分子生物学试验石耀华ppt课件

.,1,分子生物学实验,主讲教师石耀华副教授应用专业：水产养殖学,日期：2010年9月5日,.,2,实验内容,实验一动物基因组DNA提取,实验二DNA琼脂糖凝胶电泳,实验三DNA聚合酶链式反应,实验四DNA的分离回收,实验五DNA重组克隆与鉴定,实验六动物总RNA的提取与mRNA的纯化,.,3,实验一动物基因组DNA提取,1.学习动物总DNA的抽提纯化的基本原理；2.掌握苯酚/氯仿法提取基因组DNA的基本技术。,【实验目的】,.,4,通过液氮研磨等将组织块打碎为单细胞或者小的细胞团，采用去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)等破坏细胞的膜结构，使细胞膜和核膜蛋白溶解，染色质的核蛋白释放，DNA游离出来。利用蛋白酶K在50-55下消化蛋白质组分。核酸是极性化合物，溶于水而不溶于酚、氯仿和乙醇等有机溶剂，而蛋白质具有苯酚、氯仿相似相溶性，而且苯酚和氯仿可以使蛋白质变性。,【实验的基本原理和基本知识】,.,5,因此，可以采用苯酚/氯仿抽提蛋白酶消化后的匀浆液，然后根据苯酚/氯仿和水的密度差异进行离心分层，蛋白质分子溶于苯酚/氯仿相，而DNA溶于水相。水相密度较小，位于上层；苯酚/氯仿相密度较大，位于下层。吸取上层的水相而放弃下层苯酚/氯仿相，从而除掉细胞内蛋白质等。进而利用核酸不溶于醇的性质将DNA从水溶液中沉淀分离出来，去除盐分等，再用适量的灭菌水或者TE溶液溶解,.,6,一、实验器材水浴锅，离心机，移液器，解剖盘，剪刀，镊子，浮子，离心管架，1.5ml离心管，10l、200l和1ml吸头及吸头盒，记号笔等二、试剂抽体液STE10mmol/LTrisHCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LNaCl，1%2-巯基乙醇，10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，无水乙醇，70%乙醇，TE等三、实验材料活鱼,【实验用品】,.,7,1.剪取约0.2g左右的鱼鳍组织，剪碎后置于加入了0.5mlSTE的1.5ml灭菌离心管中；2.加入约65l的10%SDS至终浓度1%，然后加入5-10l蛋白酶K，盖好盖子后颠倒混匀；3.将上一步的样品置于浮子中，然后在预先调温为50-55的水浴锅中消化，每15-20min迅速颠倒摇动数次；4.鳍条上的皮肤等完全脱落消化后取出样品，室温下8000g离心2-5min；5.吸取上清至另一灭菌的1.5ml离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀5-10min；6.室温13000g离心10min；,【实验操作】,.,8,7.吸取上清至另一灭菌的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀5min；8.室温13000g离心5min；9.吸取上清至另一灭菌的1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后静置约15min；10.室温13000g离心10min；11.倒掉液体，加入1ml70%乙醇；12.室温13000g离心5min；13.重复步骤11和12；14.尽量倒干液体，室温干燥15min；15.加入100-200l或者TE溶解DNA沉淀；16.置于-20保存或者进行检测和其它实验。,.,9,1.加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇经步骤6离心后，会分为三层，请问DNA和蛋白质分别位于哪一层？DNA可能在最下层吗？为什么？2.本实验中氯仿、乙醇和SDS分别有什么作用？3.如果分别以鱼的肝脏、血液、肌肉和鱼鳍组织为材料提取的DNA，所提取的DNA组成是否会相同？请说明理由。,【作业与思考】,.,10,实验二DNA琼脂糖凝胶电泳,1.了解DNA琼脂糖电泳的基本原理；2.掌握琼脂糖电泳的基本操作和结果判读方法。,【实验目的】,.,11,琼脂糖(Agarose)是从石花菜或者其它红藻植物提取的中性不带电荷成份，凝固点较低，与水一起加热融化后，室温下半小时左右就可以凝固形成从50nm到数百纳米孔径的凝胶状固形物，孔径的大小与琼脂糖的浓度成反比。核酸分子带负电，将其加样于浸没在电泳缓冲液里的琼脂糖凝胶中，两端加上适当的电压时，核酸分子就会在电场力的作用下由阴极向阳极移动。在同一电场条件下，不同的核酸分子因分子量大小、电荷和构象等不同具有不同的运动能力，迁移速率存在差异，据此，可以将混合在一起的核酸分子分离开。,【基本原理】,.,12,琼脂糖凝胶的浓度与分离的线状DNA分子量范围,.,13,一、实验器材电子天平，微波炉，电泳仪，水平板电泳槽，三角烧瓶，制胶板和梳子，微量移液器，凝胶成像系统等二、试剂琼脂糖，DNA分子量标准，0.5TBE，6上样缓冲液，溴化乙锭(水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解，配制为10mg/ml，棕色瓶中室温或者4保存)等三、实验材料DNA溶液,【实验用品】,.,14,称样,制板,电泳操作基本程序,.,15,电泳,.,16,1.根据样品数量确定制备琼脂糖凝胶所需的溶液体积(假定为100ml)，按照1%的比例(质量提积比)称取琼脂糖粉末1g，倒入250ml的三角烧瓶中；2.量取100ml的0.5TBE缓冲液，加入三角烧瓶中，微波炉加热至完全溶解(中高火约3min)，室温或者冷水中冷却至55左右(烫手但是仍然可以用手握住)，加入千分之一的EB溶液，至终浓度为的0.5-1g/ml；3.封好制胶盘，插好梳子，将凝胶缓缓倒入制胶板中至凝胶厚度3-5mm；4.室温放置半小时以上，凝胶充分冷却凝固后，连同托板一起转移至电泳槽中；5.向电泳槽中加入0.5TBE至缓冲液高出凝胶面2-5mm，轻轻拔出梳子；,【实验操作】,.,17,6.取1lDNA样品、6l灭菌去离子水和2l6上样缓冲液，混匀；7.将制备好的DNA和上样缓冲液混合液小心地加入点样孔中，并在凝胶两侧的点样孔中各加入约20ng的DNA(或者其它DNAmarker，例如DNA的EcoRI、HindIII双酶切marker)；8.盖好电泳槽，接通电源，恒压(按正负极间距离每厘米3-5V设定)电泳；9.当溴酚蓝距离凝胶阳极端约1cm时关闭电源，停止电泳；10.取出凝胶，凝胶成像系统中观察和拍照；11.将凝胶收集至三角烧瓶中重复利用，软纸擦拭干净凝胶成像系统的观察台，关闭凝胶成像系统。,.,18,1.DNA琼脂糖凝胶迁移率受哪些因素的影响？具体说说影响的结果。2.发表的论文中核酸琼脂糖凝胶电泳图片常常是核酸呈现白色、凝胶呈黑色或者深灰色，你观察到的核酸是否与此颜色相同？为什么？3.依据你的电泳结果判断你提取的DNA是否降解了，并说明理由。,【作业与思考】,.,19,实验三DNA聚合酶链式反应,1.了解DNA聚合酶链式反应的基本原理；2.学习引物设计的基本原则；3.熟悉常规PCR仪器的使用操作。,【实验目的】,.,20,DNA聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,简称PCR)1983年由美国Cetus公司的KaryBanksMullis发明。PCR技术是一个不断重复的循环过程，每一个循环包括变性、退火和延伸三个基本步骤：a.变性。人工加热使模板DNA双链配对碱基间的氢键断裂，DNA双链解开为两条单链，一般采用94-95左右的高温处理10-30秒；,【PCR技术基本原理】,.,21,b.退火。快速降低温度，变性为单链状态的DNA因降温时间极端来不及彼此配对而仍然维持单链结构，使得反应体系中过量的单链状态的引物与模板DNA的靶序列按照碱基配对原则互补，形成局部的引物-模板DNA杂交双链。一般为37-65，因引物而异，退火时间通常为30秒；c.延伸。反应体系的温度加热升至72左右，DNA聚合酶以单链DNA为模板、以4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为原料、以引物-模板DNA杂交双链中的引物为起始点，按5-3方向逐渐复制出与模板互补的DNA区段。,.,22,PCR扩增原理图,.,23,一、实验器材移液器，PCR扩增仪，电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统，0.2mlPCR管等二、试剂上游引物，下游引物，dNTP，MgCl2，Taq酶，灭菌去离子水，反应缓冲液，上样缓冲液，EB，琼脂糖等三、实验材料动物DNA,【实验用品】,.,24,1.配制PCR反应各种试剂混合液。每个反应总体积25l，依次将各组分加入除菌的1.5ml离心管中,【实验操作】,.,25,2.轻弹离心管，混匀反应混合液，瞬间低速离心，将管壁上的混合液离心至管底，然后将反应混合液分装至0.2ml的PCR薄壁管中，每管24l;3.向每个PCR薄壁管中加入1l模板DNA，盖好管盖；4.将加好试剂的PCR薄壁管置于PCR仪中，设置PCR程序；,35个循环,944min(预变性)9430sec，Tm30sec，720.5-2min7210min,5.按start启动PCR仪，启动循环扩增；,.,26,.,27,1.PCR扩增时引物的作用是什么？如何才能设计出好的引物?2.PCR扩增时每个循环均在三个不同的温度保持了较长的时间，请说明这三个不同温度的作用。3.每个循环的变性阶段到退火阶段要迅速地降温，为什么？4.PCR反应涉及了许多试剂组分，试说明各主要成分在PCR反应过程中所起的作用。,【作业与思考】,.,28,实验四DNA的分离回收,1.了解琼脂糖中回收纯化DNA的基本原理；2.学习掌握琼脂糖电泳分离DNA回收纯化的常见方法。,【实验目的】,.,29,不同大小的DNA分子琼脂糖电泳后形成彼此分离的DNA条带，据此，溶液中分子量不同的DNA分子可以借助琼脂糖电泳实现彼此分离，进而可以将包埋了单一分子量DNA的琼脂糖凝胶条带切割下来，采用低熔点琼脂糖凝胶法、玻璃奶(Glassmilk)回收法、冻融法和电洗脱法等回收。低熔点琼脂糖凝胶法是在电泳分离DNA时将目的DNA电泳至熔点约37的低熔点胶中，然后利用凝胶容易融化的特性，65左右水浴融化后采用酚/氯仿法抽提纯化。玻璃奶法利用碘化钠(NaI)降低琼脂糖熔点，55左右水浴融化凝胶，然后利用玻璃奶颗粒小、表面积大、吸附能力强的特点，改变溶液条件，使DNA由溶液状态转变为不溶丝状而被吸附至玻璃奶颗粒表面，洗涤除掉盐分等杂质后再用TE或者除菌水洗脱DNA。,【基本原理】,.,30,冻融法是将切下的凝胶挤压研碎后将酚/氯仿法和-20冷冻条件相结合，重复提取其中的DNA。电洗脱法利用电场力的作用，使DNA自切割下来的固体琼脂糖中电泳至被包裹的透析袋溶液中，DNA分子小于透析袋孔径而留存在透析袋中，进而用常规酚/氯仿法抽提纯化。目前，为了更加快捷有效地分离回收琼脂糖中的DNA，避免使用有毒试剂酚和氯仿，以吸附DNA的特殊硅胶树脂为填充物、采用过柱离心方式分离DNA的试剂盒普遍得到使用。尽管不同公司的试剂盒具体的试剂可能有所不同，但是均是先采用类似于玻璃奶法的碘化钠(NaI)等试剂降低琼脂糖熔点，50左右水浴溶胶后再利用树脂等DNA物理吸附材料过柱漂洗和洗脱，实现DNA的回收纯化。,.,31,一、实验器材离心机，水浴锅，电泳仪，微波炉，凝胶成像系统，涡旋振荡器，移液器，小刀，1.5ml离心管，吸头，离心管架等二、试剂(一)玻璃奶法普通琼脂糖，EB，TBE，上样缓冲液，DNAmarker，碘化钠，玻璃奶，漂洗液，无水乙醇，除菌TE或者去离子水等。(二)普通DNA凝胶回收试剂盒法天根生化科技(北京)有限公司DP209-离心柱型-普通DNA凝胶回收试剂盒等三、实验材料待回收DNA,【实验用品】,.,32,1.制备1%的常规琼脂糖凝胶，上样电泳；2.紫外光下切取目的DNA条带所在的凝胶块，修除去掉无DNA的凝胶部分；3.称量修理后的凝胶块重量，置于1.5ml离心管中，加入3倍体积(V/W)的熔胶液碘化钠溶液；4.盖好离心管盖子，约55水浴至凝胶完全溶化；5.漩涡振荡混匀玻璃奶后取20l加入完全溶化的凝胶液中，室温颠倒混匀5min；,玻璃奶法,【实验操作】,.,33,6.室温、12000g离心30秒，小心吸除上清液；7.加入0.5ml漂洗液，混匀，室温、12000g离心30秒，小心吸除上清液；8.重复上一步两次；9.吸水纸上倒置，室温干燥约15min；10.加入20l除菌的TE或者去离子水，手指弹离心管底，混匀后55水浴5min助溶；11.室温、12000g离心3min，小心吸取上清液；12.取1ul电泳检测回收效果。,.,34,1.制备1%的常规琼脂糖凝胶，上样电泳；2.紫外光下从琼脂糖凝胶中切下目的条带凝胶块，修除去掉无DNA凝胶部分，称重量；3.置于1.5ml离心管中，加入3-5倍体积的溶胶液PN，约55水浴至凝胶充分溶解；4.将500l平衡液BL加入放置于收集管中吸附柱CA2中，室温、12000g离心30秒，倒掉收集管中的废液；5.水浴好的凝胶冷却至室温后转入上一步平衡后的吸附柱CA2中，室温放置2-5min使DNA充分吸附；,普通DNA凝胶回收试剂盒法,.,35,6.室温、12000g离心30秒，倒掉收集管中的废液；7.加700l漂洗液，放置2-5min，室温、12000g离心30秒，倒掉收集管中的废液；8.重复步骤7；9.室温、12000g离心2min，使吸附柱中的乙醇尽量除去；10.弃收集管，将吸附柱CA2中转入灭菌的干净1.5ml离心管中，悬垂加入50-100l60预热的洗脱液EB或者去离子水，室温或者50恒温箱中放置2-5min，室温、12000g离心1min；11.弃吸附柱，取1ul收集液电泳检测。,.,36,.参照DNAmarker，根据回收前、后电泳的条带亮度估计DNA的量，并计算DNA的回收率，评估你回收DNA的效果。2普通DNA凝胶回收试剂盒法步骤5、7、9中均放置2-5min，分别有什么作用？3.如果这三种方法任你选择，你会采用哪一种方法纯化回收PCR产物中的目的DNA分子？为什么？,【作业与思考】,.,37,实验五DNA重组克隆与鉴定,1.掌握DNA重组和转化的基本原理；2.了解重组子鉴定筛选的原理与方法。,【实验目的】,.,38,【实验的基本原理】,基因克隆时的DNA重组常常是将待克隆的外源DNA分子与质粒载体进行连接组合；然后，采用热激处理，即感受态大肠杆菌与重组质粒冰浴混匀后迅速在42水浴中热激处理数十秒钟，细菌的细胞壁和细胞膜结构改变，生理生化状态也发生变化，从而将外源的质粒DNA摄入，包括重组子的吸附、导入、复制和表达等几个基本过程。转化后被转入的重组质粒在宿主细菌体内随着细菌的分裂增殖而迅速扩增，细菌获得了被转入的重组子的遗传物质，具有由此产生的新的遗传特征。,DNA重组转化基本原理,.,39,互补的蓝白筛选原理,质粒载体都含有大肠杆菌-半乳糖苷酶的启动子等调控序列和肽链的DNA序列，该结构即为lacZ基因，指导编码-半乳糖苷酶N端的146个氨基酸。在编码区中插入了一个不破坏lacZ基因阅读框架的多克隆位点，不影响正常功能。宿主菌则具有-半乳糖苷酶C端编码区DNA序列。质粒载体没有转入宿主菌内时，二者相互独立，分别编码的是不完整的-半乳糖苷酶区段，因而均没有-半乳糖苷酶活性；一旦该质粒载体转入宿主菌中，质粒载体和宿主菌上的-半乳糖苷酶基因片段相互结合互补，可以形成具有-半乳糖苷酶活性的蛋白质，这种现象被称为-互补。,.,40,当质粒中没有插入外源目的DNA片段时，质粒中的-半乳糖苷酶基因与宿主菌中的-半乳糖苷酶基因互补，在异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下，形成活性的-半乳糖苷酶。当培养基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)时，-半乳糖苷酶就可以将X-gal分解为半乳糖和5-溴-4-靛蓝，后者为深蓝色，从而使菌落也呈现深蓝色。如果质粒的多克隆位点中插入了外源目的DNA片段，则质粒上-半乳糖苷酶的肽链编码区结构发生改变，不能合成原有的肽链N端，进而不能与宿主菌中的-半乳糖苷酶肽链C端互补，不具备-半乳糖苷酶活性，不能降解X-gal，此时菌落呈现白色。因此，导入含有目的DNA分子的重组子的阳性菌落显示白色，而导入的是没有目的DNA分子纯载体的阴性菌落则显示蓝色。,.,41,.,42,一、实验器材超净工作台，离心机，恒温培养箱，灭菌锅，水浴锅，低温水浴锅，恒温摇床，冰箱，培养皿，涂布棒，移液器，酒精灯，0.2ml薄壁管，1.5ml离心管等二、试剂LB液体培养基(NaCl10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，pH7.0)，氨苄青霉素溶液(50mg/ml)，T4DNA连接缓冲液，T4DNA连接酶，X-gal(甲酰胺配制，20mg/ml，-20避光保存)，IPTG(除菌蒸馏水配制，200mg/ml)，LB固体培养基灭菌的LB固体培养基冷却至60左右时加入氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)至终浓度50g/ml，倒在培养皿上铺平板等三、实验材料】外源DNA，质粒载体，感受态大肠杆菌,【实验用品】,.,43,1.0.1lT载体和等摩尔质量的外源DNA加入0.2ml的PCR薄壁管中，加除菌水至5l；2.加入5l的2T4DNA连接酶缓冲液，混匀后加入0.1Weiss单位T4DNA连接酶，16温育1-小时，或者4过夜连接；3.取冰浴融化的感受态大肠杆菌100l至冰上1.5ml离心管中，再加入1-5l连接的质粒DNA(约20-50ng)，混匀，冰浴20-30min；4.水浴锅中42静置90秒；5.冰上冷却2-5min；,【实验操作】,.,44,6.加入900l液体LB培养基，37摇床中150-200rpm摇动复苏50min，使大肠杆菌恢复正常状态，并表达质粒DNA编码的抗生素抗性基因；7.在超净工作台上无菌条件下吸取100-200l菌液，分别加入2-4lX-gal和IPTG，混匀后用涂布棒(弯头玻棒)轻轻地均匀涂布至含约50-100g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基中；8.室温正置培养平板约30min左右至培养基表面液体被吸收；9.37培养箱中倒置过夜培养(12-16h)；10.观察统计蓝色和白色菌落数量，计算转化率。,.,45,1.统计蓝、白菌落的数量，计算转化效率。2.试述鉴别空质粒和重组子转化克隆的筛选原理。3.分析你的转化实验成功或者失败的原因。4.假如阴性对照组培养平板中生长出了一些菌落，请问可能的原因是什么？,【作业与思考】,.,46,实验六动物总RNA的提取与mRNA的纯化,1.了解从动物组织中提取总RNA的基本原理与方法；2.了解总RNA纯化为mRNA的基本原理；3.掌握RNA质量的分析方法。,【实验目的】,.,47,RNA酶很难失活，因而RNA很容易在细胞破裂后的提取过程中被RNA酶降解。在提取过程中需要抑制内、外源RNA酶的活性，并采取措施去除RNA酶。RNA抽提试剂中高浓度的异硫氰酸胍是强变性剂，它与强还原剂-巯基乙醇共同抑制RNA酶活性，并且与十二烷基肌氨酸钠共同作用，使蛋白质变性，破坏细胞结构，使核酸与核蛋白彼此分离。由于内、外源的RNA酶活性被抑制，细胞中释放出来的RNA不会被降解；在酸性条件下，DNA分子基本上不会发生解离，进而在用酚、氯仿等有机溶剂处理和离心时与变性的蛋白质以及细胞碎片一起被分离至有机相或者有机相与水相的界面层，而RNA则溶于水而存在于上层的水相中；然后对水相进行抽提、沉淀和洗涤后就可以得到较纯净的高质量总RNA。,【基本原理】,总RNA提取,.,48,总RNA中含有大量的tRNA和rRNA，尤其是rRNA比例极高，而mRNA的比例很小，只占其中的1%左右。研究基因表达时，需要从总RNA中将mRNA分离纯化出来。真核生物mRNA的5端有帽子结构(m7G)而3末端含有多聚腺苷酸Poly(A+)尾。在高盐缓冲液中，mRNA由于存在多聚腺苷酸Poly(A+)尾，可以与寡聚(dT)纤维素特异地结合，而tRNA和rRNA等则不能够结合，进而被洗脱去除；漂洗后，在低盐浓度或者去离子水中mRNA则会被洗脱，从而得到纯化的mRNA。,真核生物mRNA纯化,.,49,.,50,一、实验器材磁力搅拌器，高压灭菌锅，冷冻台式高速离心机，匀浆器，200以上烘箱，琼脂糖胶电泳系统，凝胶成像系统，低温冰箱，剪刀，镊子，移液器，吸头，离心管，一次性手套等二、试剂DEPC，Trizol，Tris-HCl平衡酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，无RNA酶75%乙醇(DEPC处理水配制)，异丙醇，琼脂糖，无RNA酶去离子水，Promega公司PolyATtractmRNAIsolationSystemIII(试剂盒)，无RNA酶去离子水配制的5TBE，3M醋酸钠(pH5.2)，上样缓冲液等，甲醛(37%溶液)，去离子甲酰胺，溴化乙锭(EB,10mg/ml)等三、实验材料活鱼,【实验用品】,.,51,1.剪取0.2g肝脏等组织，分别加入1mlTRIZOL，匀浆(或者在液氮中研磨至细粉，转入加有1mlTRIZOL预冷的1.5ml离心管，震荡混匀)；2.室温放置5min后，加入0.5ml的平衡酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，剧烈颠倒摇动5min；3.室温静置5-15min；4.4、12000g离心10min；5.此时溶液分为：最下层的红色有机相(苯酚、氯仿和DNA)，白色的中间层(主要是变性蛋白)和无色的上层水相(RNA溶液)。吸取上层水相至无RNA酶1.5ml干净离心管；,【实验操作】,总RNA提取,.,52,6.加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒摇动5min；7.4、12000g离心10min；8.吸取上层水相至无RNA酶1.5ml干净离心管中，加入等体积冰冷的异丙醇，室温静置20min；9.4、12000g离心10min，RNA沉淀至管壁和底部，弃上清；10.加入1mlDEPC水配制75%乙醇，4、12000g离心10min，弃上清；11.重复上一步；12.室温干燥10min使乙醇充分挥发，加入50lDEPC处理过的无RNA酶去离子水，溶解RNA，取1l用于电泳，其余进行mRNA纯化或者储藏于-80冰箱备用；,.,53,13.取不少于10mg的总RNA溶解于500L无RNA酶去离子水中，65水浴10min；14.先后加入3l生物素标记的寡聚(dT)探针和13l20SSC；15.手指轻弹管底混匀，室温放置10min；16.加入0.3ml0.5SSC至盛有链亲和素包裹磁珠的离心管中，重悬浮磁珠，置磁架上将磁珠吸到管壁上，