SN∕T 5226-2019 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光PCR方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 52262019 2019-12-27 发布2020-07-01 实施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布 ICS 67.120 X04 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光PCR法 Detection of Trionyx Sinensis ingredient in export food Real-time rluorescent PCR method 出口食品中鳖成分的检测.indd 12020/1/19 10:09:41 出口食品中鳖成分的检测.indd 22020/1/19 10:09:41 I SN/T 52262019 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 和 GB/T 20001.42002 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国大连 海关、中华人民共和国厦门海关。 本标准主要起草人：苗丽、李想、张秀平、黄新新、郭德华、郑秋月、孔凡德、徐淑菲、黄世 英、李志娟。 出口食品中鳖成分的检测.indd 12020/1/19 10:09:41 出口食品中鳖成分的检测.indd 22020/1/19 10:09:41 1 SN/T 52262019 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了出口食品中鳖源性成分的实时荧光 PCR 检测方法。 本标准仅适用于食品中中华鳖、黄沙鳖、黑鳖、珍珠鳖、山瑞鳖、刺鳖、小鳖、印度小头鳖和 缅甸缘板鳖等鳖成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鳖 Trionyx Sinensis 是爬行纲龟鳖目鳖科鳖亚科的一类水陆两栖爬行动物。其肉营养丰富，是滋补佳品，同时鳖肉和 鳖甲等也用作药材。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction ；PCR 模板基因序列先经高温变性成为单链，在 DNA 聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列 设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 DNA 聚 合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和 延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。 3.3 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程。 出口食品中鳖成分的检测.indd 12020/1/19 10:09:41 2 SN/T 52262019 3.4 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。 PCR ：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。 dNTP ：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。 dATP ：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。 dCTP ：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 dGTP ：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 dTTP ：deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸。 Tris ：Tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 EDTA ：Ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 Taq ：Thermus aquaticus，水生栖热菌。 OD ：optical density，光度密度。 FAM ：Carboxyfluorescein，羧基荧光素。 BHQ1 ：Black hole quencher 1，黑洞猝灭基团 1。 5 方法提要 样品经研磨后，提取 DNA，以 DNA 为模板，采用鳖线粒体细胞色素 b 基因的特异性检测引物和 探针，进行实时荧光 PCR 扩增，观察实时荧光 PCR 的增幅现象，判断样品中是否存在鳖成分。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 6.1 检测用引物和探针 鳖成分扩增引物和探针详见表 1。鳖引物扩增的靶标序列见附录 A。 表 1 鳖成分扩增引物和探针 名称引物 / 探针序列（5 3）扩增片段长度靶基因 鳖-FCCAYYTGATGAAACTTTGGATC 157 bpcytochrome b鳖-RCGGATTAGTCAACCGTATTGTAC 鳖-PFAM-TCACCAAAYATCTCYACAGCATTCTC-BHQ1 注：Y 代表碱基 C 或 T。 出口食品中鳖成分的检测.indd 22020/1/19 10:09:41 3 SN/T 52262019 6.2 试剂 6.2.1 组织裂解液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0） ；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） ；10%（质量浓度）SDS。 6.2.2 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL） 。 6.2.3 饱和酚。 6.2.4 三氯甲烷。 6.2.5 异戊醇。 6.2.6 75% 乙醇。 6.2.7 NaAc 溶液（3 mol/L） 。 6.2.8 TE 缓冲液（Tris-HCl、EDTA 缓冲液） ：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） ，1 mmol/L EDTA（pH 8.0） 。 6.2.9 实时荧光 PCR 反应混合液：12.5 L 反应体系包括 1U3 U 的 Taq 酶、1PCR 缓冲液、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+、0.2 mmol/L 的 dNTP。如果具有等效的商品化试剂盒，也可使用这些等效产品。 7 仪器和设备 7.1 实时荧光 PCR 仪。 7.2 离心机：离心速度不低于 12 000 r/min。 7.3 恒温水浴锅。 7.4 天平：感量 0.1 g、0.01 g。 7.5 微量移液器：10 L、100 L 、200 L、1 000 L。 7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.7 涡旋振荡器。 7.8 研钵及粉碎装置。 7.9 pH 计。 7.10 冰箱 2 8 、-20 。 8 检验步骤 8.1 DNA 提取 称取待检样品 200 g，研磨混匀，然后称取 100 mg 上述样品于 1.5 mL 离心管中，加入 700 L 预 热（56 ）的组织裂解液和 20 L 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL） ，使用涡旋振荡器混匀，56 水浴 2 h， 期间振荡混匀；向各管加入 700 L 饱和酚，上下颠倒混匀，12 000 r/min 4 离心 10 min ；转移上清 于洁净离心管中，加入 1/2 上清体积的饱和酚及 1/2 上清体积的三氯甲烷：异戊醇（24 ： 1）上下颠倒 混匀，12 000 r/min 4 离心10 min；转移上清于洁净离心管中，加等体积的三氯甲烷 ： 异戊醇（24 ： 1）上下 颠倒混匀，12 000 r/min 4 离心 10 min ；转移上清于洁净离心管中，加等体积的三氯甲烷， 12 000 r/min 4 离心 10 min ；取上清约 400 L，加 2.5 倍体积的冷的无水乙醇和 1/10 体积的 NaAc 溶液（3 mol/L） ， - 20 沉淀 2 h 或者沉淀过夜；12 000 r/min 4 离心 30 min，弃液，加 1 000 L 75% 冷的乙醇， 12 000 r/min 4 离心 10 min ；弃上清，自然干燥后加入 50 L TE 缓冲液（pH8.0）溶解 DNA 沉淀，于 - 20 保存备用。 注：也可采用等效的 DNA 提取试剂盒提取样品 DNA。 8.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260和 A280。DNA 的浓度按照式（1）计算： 出口食品中鳖成分的检测.indd 32020/1/19 10:09:41 4 SN/T 52262019 c=A260N50 （1） 式中： c DNA 浓度，单位为微克每毫升（g/mL） ； A260260 nm 处吸光值； N核酸稀释倍数。 A260 /A 280比值在 1.71.9 之间时，适于实时荧光 PCR 扩增。 8.3 实时荧光 PCR 检测 8.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 按照表 2 配制实时荧光 PCR 反应体系。每个样品进行检测时应设置 2 个平行。 表 2 实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称工作液浓度加样量 /L反应体系终浓度 PCR 反应混合液（2）112.51 鳖-F10 mol/L1.0400 nmol/L 鳖-R10 mol/L1.0400 nmol/L 鳖-P10 mol/L0.5200 nmol/L DNA 模板10 ng/L100 ng/L2.0 去离子水补齐至 25 L 8.3.2 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光 PCR 反应条件，随着仪器不同略有改变，一般为：95 /10 min；95 /15 s，58 /60 s，40 个循环。 8.3.3 实验对照 检验过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含有鳖成分的样品做阳性对照， 用已知不含鳖成分的样品做阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板 DNA 做空白对照。 9 质量控制 9.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于 40.0。 9.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于 40.0。 9.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。 10 结果判定及表述 10.1 结果判定 在符合第 9 章的情况下，可做出如下结果判定： a）如 Ct 值小于等于 35.0，则判定为被检样品阳性； 出口食品中鳖成分的检测.indd 42020/1/19 10:09:41 5 SN/T 52262019 b）如 Ct 值大于等于 40.0，则判定为被检样品阴性； c） 如大于 35.0 小于 40.0，则重复一次。如再次扩增后 Ct 值仍为小于 40.0，则判定被检样品阳性； 如再次扩增后 Ct 值大于等于 40.0，则判定被检样品阴性。 10.2 结果表述 10.2.1 结果为阳性者，表述为“检出鳖成分” 。 10.2.2 结果为阴性者，表述为“未检出鳖成分” 。 11 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录 D 的规定执行。 12 检出限 本方法所规定的最低检出限为 0.01%（质量百分比） 。 出口食品中鳖成分的检测.indd 52020/1/19 10:09:41 6 SN/T 52262019 附 录 A （资料性附录） 鳖成分基因扩增参考序列 A.1 中华鳖 Pelodiscus sinensis ccatttgatgaaactttggatcattattaggagcctgcttaatactacaaatcatcacaggcctattcctagccatacattactcaccaaacatctcaacagcatt ctcgtcaatcgcccacattacccgagatgtacaatacggttgactaatccg A.2 山瑞鳖 Palea steindachneri ccacttgatgaaactttggatccctattaggtgcttgcctaatcctacaaatcattacaggactattcttagccatacattattcaccaaacatctcaacagcattct catcaatcgcccatatcacccgagacgtacaatacggttgactaatccg A.3 刺鳖 Apalone spinifera ccatctgatgaaatttcggatccctattaggcgcttgcctagccatccaaatcatcacagggttattcctagccatgcattactcaccaaacatcttaacagcatt ctcatcagtttcccacatcacccgggatgtacaatacggctgattaatccg A.4 珍珠鳖 Apalone ferox ccatctgatgaaatttcggatccctactaggcgcttgcctggccatccaaatcatcacaggattattcctagccatacattactcaccaaacatcttaacagcatt ctcatcaa