第10章生物碱类药物分析

第十章生物碱类药物的分析,第一节概述,一、生物碱（Alkaloids）生物碱是生物体内含氮有机化合物的总称,二分类,1.芳烃胺类硫酸苯丙胺，精神振奋药pKb=9.9盐酸麻黄碱，肾上腺受体激动药,2.异喹啉类盐酸吗啡，镇痛药pKb1=6.13，pKa=9.9磷酸可待因，镇痛镇咳药；盐酸黄连素，抗菌药；度冷丁等,3.喹啉类硫酸奎宁，抗疟药；异构体硫酸喹尼丁，抗心率失常药；pKb1=5.07，pKb2=9.7,4.托烷类硫酸阿托品，抗胆碱药pKb=4.35,氢溴酸东莨菪碱，抗胆碱药pKb=7.6；5.黄嘌呤类咖啡因，pKb=14.15（碱性极弱）；茶碱，平滑肌松弛药，含活泼氢酸性；,6.吲哚类硝酸士的宁，中枢神经兴奋药pKb1=6.0，pKb2=11.7（酰胺）硫酸长春新碱，抗肿瘤药；利血平，抗高血压药；,7.其他类硝酸毛果芸香碱，缩瞳药。由上可知，生物碱类药物有如下特点。,典型药物的结构,三、特点1.数量多，绝大多数存在于植物体内；已发现3000多种，100多种有效，中成药中富含生物碱。2.生理活性强，但大都有毒性因此，质量控制和临床应用尤应慎重，许多为特殊管制药物，并已超出药物分析的范畴，体育运动中的兴奋剂问题，世界关注的毒品问题，许多是生物碱类成分。该类药物的质量应严格控制，以保证用药的安全和有效。我们药物分析学所关注的是其结构特征和利用这些特征，建立相应的鉴别、检查和含量测定。,3.结构特点,1）这类药物没有共同的母核2）.多数生物碱类药物的分子中具有含氮杂环的结构，少数氮在侧链上（如麻黄碱）3）.生物碱类药物最显著的特点就是具有碱性。4.）对生物碱类药物的鉴别、含量测定，大多数的方法是利用生物碱类药物整个分子的碱性进行的。,四、生物碱类药物的通性,1.碱性：N原子的存在，强弱从N上的取代基是供电子还是吸电子基团，空间位阻两方面考虑。,如果N原子周围连接有供电子基团，如-OH、-OR、-R时，这些基团通过诱导效应或共轭效应，能够使N上电子云密度增加，使N原子吸引质子的能力增大，所以它的碱性就强。（N上有供电子取代基，N上ed、N与质子结合能力、碱性）相反，如果N原子上有吸电子基团，如-NO2、-COOH等时，则能使N原子吸引质子的能力减小，这样它的碱性就弱。,1）一般情况：季铵仲铵伯铵叔铵NH3环酰铵2）脂肪铵脂环铵芳铵3）个别两性化合物如吗啡有酸性（酚羟基），茶碱只有酸性（活泼氢）季铵碱脂肪胺、脂环胺芳胺、N芳杂环酰胺小檗碱麻黄碱、阿托品罂粟碱咖啡因吗啡具酸碱两性,2.存在状态多数以盐的形式存在1）植物中多与有机酸成盐如吗啡罂粟酸盐，鞣酸奎宁盐；2）药用多为多为无机酸盐如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸盐。含量测定应考虑上述2个因素，碱性强弱选择滴定溶液和指示剂，成盐的情况在非水滴定时要考虑对滴定的干扰。,3.溶解性1）共性：游离生物碱易溶于CHCl3等中等极性有机溶剂，难或不溶于水，溶于稀酸溶液；成盐易溶于水；2）个性：有的生物碱能溶于水，如麻黄碱、烟碱等具有酸碱两性的生物碱，可在碱的水溶液中成盐而溶解，如吗啡、茶碱等碱性较弱的生物碱不能与酸形成稳定的盐，如咖啡因、利血平等溶解性可以用于提取分离和鉴别时的重要依据。,4.光谱特点1）旋光性多含不对称碳原子，故有旋光性，药效学研究表明许多手性药物一般效用不同，或药效有强弱、或效价低、或无效，甚至有毒副作用。如今手性合成和分离是药学研究的热点和难点之一；一般多为左旋体有效。2）紫外吸收多含不饱和双键。5.与生物碱沉淀试剂和显色试剂反应上述是生物碱类药物的一般共性。,6.取代基的性质（个性）1）氨基醇（苯丙胺、伪麻黄碱）（1）还原性：可与高锰酸钾等氧化剂反应生成甲胺，有碱性；（2）双缩脲反应：硫酸铜和氢氧化钠试液反应生成蓝紫色配位化合物；2）酚羟基（吗啡）Marquis反应硫酸-甲醛氧化成醌，显色；3）酯的结构（托烷类）Vitaili反应如阿托品水解成莨菪酸，可与发烟硝酸共热，生成黄色硝基衍生物。,4）奎宁类（喹啉类）绿奎宁反应，微酸性水溶液，滴加Br2或Cl2水，加过量氨水，呈翠绿色；5）异喹啉类（黄连素）热碱（NaOH）作用，转变为季铵盐碱性及其互变异构体，呈橙红色，与丙酮作用，生成黄色沉淀；6）黄嘌呤类（咖啡因）紫脲酸铵反应，HCl，KClO3，加热放出氨气呈紫色，加碱消失；7）吲哚类生物碱（士的宁、利血平和长春新碱）呈吲哚颜色反应，如与香草醛试剂反应。,第二节鉴别试验,一、特征鉴别反应（一）双缩脲反应侧链具有氨基醇结构,（二）Vitali反应托烷生物碱,（三）绿奎宁反应硫酸奎宁、硫酸奎尼丁,（四）Marquis反应吗啡生物碱,（五）Frohde反应吗啡生物碱,（六）官能团反应吲哚生物碱,1.利血平+新制香草醛玫瑰红色,2.,（七）紫脲酸胺反应黄嘌啉类生物碱,（八）还原反应吗啡与磷酸可待因的区分反应,二、一般鉴别反应,（一）熔点测定法（二）沉淀反应,常用的生物碱沉淀试剂为：1.重金属盐类，如K2HgI4、KBiI4、I2KI、二氯化汞等；2.大分子酸类，如磷钼酸、硅钨酸等。,（三）显色反应常用的显色试剂：浓硫酸、浓硝酸、钼硫酸、钒硫酸、硒硫酸、甲醛硫酸等,（四）UV（五）IR,（六）色谱法1.HPLC2.TLC,硅胶为吸附剂：游离生物碱能顺利迁移，生物碱盐类吸附太牢，造成严重拖尾。解决方法：（1）在展开剂中加少量的碱性试剂，如氨、二乙胺、有机脂烃胺类；（2）硅胶板用碱处理,第三节特殊杂质检查,特殊杂质检查主要根据药物与杂质的理化性质差异来进行。,利用药物和杂质在颜色、溶解行为、旋光性质、对光吸收选择性等物理性质上的差异，检查杂质是否符合限量规定,一、物理法,利用药物与杂质在挥发性、臭味等方面的差异进行检查。,（一）臭味及挥发性的差异,ChP（2000）麻醉乙醚中异臭的检查取本品10ml，置瓷蒸发皿中，使自然挥发，挥散完毕后，不得有异臭。,（二）颜色的差异,ChP（2000）盐酸阿扑吗啡检查分解产物取本品0.10g，加无水氧化物的乙醚5ml，振摇后，乙醚液只许显极淡的红色。,（三）溶解行为的差异,利用药物与杂质在溶解性方面的差异进行检查。如葡萄糖中糊精的检查。,（四）旋光性质的差异,ChP（2000）硫酸阿托品检查莨菪碱取本品，按干燥品计算，加水制成每1ml中含50mg的溶液，依法测定（附录E），旋光度不得过0.40。,（五）对光吸收性质的差异分光光度法,利用药物与杂质在紫外吸收光谱方面的差异进行检查。,1.紫外分光光度法,例1.中国药典（2000年版）规定肾上腺素中检查肾上腺素酮的方法为：取本品，加盐酸溶液（92000）制成每1ml中含2.0mg的溶液，于310nm波长处测定，吸收度不得超过0.05，已知肾上腺素酮在310nm波长处的为453，肾上腺素在该波长处无吸收。请计算肾上腺素酮的限量应为（D）A.0.1B.0.5C.0.04D.0.06%E.0.0002,2.IR,用于药物中无效或低效晶型的检查。利用药物与杂质有特征峰差异进行检查。如甲苯咪唑中A晶型的检查、无味氯霉素混悬剂中A晶型的检查。,X射线粉末衍射法,3.原子吸收分光光度法,主要用于金属元素的检查，具有灵敏度高、选择性好等优点。如肝素钠中钾盐的检查。,（六）吸附或分配性质的差异色谱法,1.TLC,（1）杂质对照品法,（2）高低浓度对比法,（3）参比杂质对照品法选用可能存在的某种物质作为杂质对照品。,（4）选用质量符合规定的与供试品相同的药物作为杂质对照品。,2纸色谱,用于极性较大药物中杂质的检查或放射性药物注射液（或溶液）中放射化学杂质的检查。如地高辛中洋地黄毒苷的检查。,缺点：展开时间长，斑点扩散，不能用强酸等腐蚀性显色剂,3HPLC,（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量,准确测定杂质含量,方法,内标物+杂质对照品对照溶液，进样，测定，计算校正因子,供试品+内标供试品溶液，进样，测定杂质和内标峰面积或峰高，计算杂质含量,（2）外标法测定供试品中某个杂质的含量,供试品供试品溶液,杂质对照品对照品溶液进样，测定，计算杂质的含量,缺点：不易准确控制进样量，宜用定量环进样,（3）加校正因子的主成分自身对照法,方法,待测成分对照品+杂质对照品溶液，进样，记录色谱图，计算杂质的校正因子,分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。,（4）不加校正因子的主成分自身对照法,无杂质对照品，且杂质峰面积与主成分峰面积相差悬殊时应用。,方法,分别进样，测定供试品溶液中各杂质峰面积及其总和，与对照溶液主成分峰面积比较，控制供试品中杂质的量。,缺点：检测波长处，各杂质和药物的吸收强度可能有差异，准确度差,优点：不需杂质对照品，可同时控制各个杂质及其总量限度,（5）面积归一化法,取一定量供试品溶液进样，测定各杂质及药物的峰面积，计算各杂质峰面积及其总和占总峰面积的百分率，不能超过限量。注意溶剂峰不应计算在总峰面积内。,优点：不需杂质对照品，简便易行。,缺点：检测波长处，各杂质和药物的吸收强度可能有差异，控制杂质峰面积百分率不一定就是杂质限量，准确度差。,4GC用于药物中挥发性杂质的检查。如药物中有机溶剂残留量测定。检查方法同HPLC。,二、化学法,利用药物与杂质在化学性质上的差异进行检查。如阿司匹林中水杨酸的检查。,98：77乙醇中检查杂醇油是利用（C）A.颜色的差异B.旋光的差异C.臭味及挥发性的差异D.对光选择吸收的差异E.溶解行为的差异,例.药物中特殊杂质的检查方法有（ABCDE）A沉淀法与颜色法B滴定法C旋光法D分光光度法E色谱法,例.HPLC检查药物中杂质的具体方法有（ABCDE）A峰面积归一化法B主成分自身对照法C内标法D外标法E内标法加校正因,例.最常用于药物中特殊杂质检查的方法是(A)A.TLCB.IRC.UVD.MSE.NMR,例.红外分光光度法在杂质检查中主要用于（A）A.药物中无效或低效晶型的检查B.杂质特征峰的确定C.杂质相关峰的确定D.杂质官能团的确定E.药物和杂质的鉴别,一、非水溶液滴定法（非水碱量法）原料药（一）原理水溶液中滴定突跃不明显，在非水介质中，碱性增强，使滴定顺利进行,第四节含量测定,1.溶剂酸性溶剂：冰醋酸、冰醋酸+醋酐、醋酐惰性溶剂：苯、氯仿、四氯化碳能影响溶质的解离情况和能影响酸碱强度很大的溶剂：硝基甲烷、丙酮、二氧六环,2.滴定剂：高氯酸的冰醋酸溶液或高氯酸的二氧六环溶液,3.指示终点的方法电位法：玻璃甘汞电极系统指示剂法：结晶紫、喹哪啶红等,有机碱及其盐类及有机酸碱金属盐类,8pKb10冰醋酸作溶剂10pKb12冰醋酸+醋酐pKb12醋酐,（二）适用范围,一般采用半微量法。中国药典（2000年版）的测定方法为：取经适当方法干燥的供试品适量约消耗高氯酸滴定液（0.1mol/L）8ml，加冰醋酸1030ml使溶解。若供试品为氢卤酸盐，应再加5醋酸汞的冰醋酸溶液35m1，加各药品项下规定的指示液12滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。,（三）一般测定方法,取本品约0.15g，精密称定，加醋酐冰醋酸（51）的混合液25ml，微热使溶解，放冷，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液显黄色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于19.42mg的C8H10N4O2。,咖啡因ChP(2000),（四）生物碱盐类的滴定,置换滴定：,无机酸在冰醋酸中的酸性次序为：,高氯酸氢溴酸盐酸硫酸硝酸其它弱酸（磷酸、有机酸）,由于有机酸系弱酸，被高氯酸置换出的HA，对滴定无干扰，能准确滴定。,1.有机酸盐的测定,取本品约60mg，精密称定，加冰醋酸20ml溶解后，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.05mo1/L）滴定，至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.05mol/L）相当于22.07mg的C19H23N3O2C4H4O4。,马来酸麦角新碱ChP(2000),若被置换出的有机酸不溶于冰醋酸，应先将样品碱化，有机溶剂提取游离碱后，再非水碱量法测定。,一般均预先在溶液中加入Hg(Ac)2的冰醋酸溶液，以消除氢卤酸对滴定的干扰。,理论量13倍,2.氢卤酸盐的测定,取本品约0.15g，精密称定，加冰醋酸10ml，加热溶解后，加醋酸汞试液4ml与结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定至溶液显翠绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于20.17mg的C10H15NOHCl。,盐酸麻黄碱ChP(2000),生物碱的硫酸盐，在冰醋酸介质中只能被滴定至生物碱的硫酸氢盐。,（1）直接滴定,3.硫酸盐的测定,A.硫酸阿托品HClO4直接滴定时，反应摩尔比为11,B.硫酸奎宁HClO4直接滴定时，反应摩尔比为13,（2）加入高氯酸钡消除硫酸的干扰后滴定硫酸奎宁反应摩尔比为12硫酸阿托品一元碱不能滴定,因HNO3具有氧化性，可使指示剂变色，一般电位法指示终点。如硝酸士的宁、硝酸毛果芸香碱,4.硝酸盐的测定,取本品约0.3g，精密称定，加冰醋酸20ml，振摇使溶解，照电位滴定法（附录A），用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于39.74mg的C21H22N2O2HNO3。,硝酸士的宁ChP(2000),按常法测定，如磷酸氯喹、磷酸可待因,5.磷酸盐的测定,简便、快速、准确、精密、取样量小，测定的是生理活性部分。如有酸性或碱性成分存在时会影响，选择性差，不能直接用于制剂分析，只能用于原料药测定。,（五）特点,（1）一般是取一定量样品在水浴上蒸干，在一定温度下干燥后按原料药物项下的方法进行。主药对热稳定,（六）制剂分析,1.注射剂,精密量取本品10ml，置水浴上蒸干，在105干燥1h，放冷，加冰醋酸10ml，与醋酸汞试液6ml使溶解，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液显绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于37.58mg的C20H21NO4HCl。,盐酸罂粟碱注射液ChP（2000）,（2）碱化，经有机溶剂反复提取完全，蒸去溶剂后，再按原料药方法进行。主药对热不稳定,二盐酸奎宁注射液ChP（2000）精密量取本品适量（约相当于二盐酸奎宁0.15g），置分液漏斗中，加水使成20ml，加氨试液使成碱性，用氯仿分次振摇提取，第一次25ml，以后每次各10ml，,至奎宁提尽为止，每次得到的氯仿液均用同一份水洗涤2次，每次5ml，洗液用氯仿10ml振摇提取，合并氯仿液，置水浴上蒸去氯仿，加无水乙醇2ml再蒸干，在105干燥1h，放冷，加醋酐5ml与冰醋酸10ml，溶解后，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液显蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于19.87mg的C20H24N2O22HCl。,片剂中许多赋形剂如硬脂酸盐、苯甲酸盐、羧甲基纤维素钠等都消耗高氯酸，因此片剂的测定一般需提取分离并经干燥后才可进行。,2.片剂：,如硫酸奎宁片、硫酸奎尼丁片碱化、有机溶剂提取后，HClO4滴定时，反应摩尔比为14,硫酸奎宁片ChP（2000）取本品10片，除去糖衣后，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于硫酸奎宁0.3g），置分液漏斗中，加氯化钠0.5g与0.1mol/L氢氧化钠溶液10ml，混匀，精密加氯仿50ml，振摇10min，静置，分取氯仿液，用干燥滤纸滤过。,精密量取续滤液25ml，加醋酐5ml与二甲基黄指示液2滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液显玫瑰红色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于19.57mg的（C20H24N2O2）2H2SO42H2O。,二、提取中和法（提取酸碱滴定法、提取容量法）,（一）原理与方法,1.碱化,2.有机溶剂提取,3.中和法测定,（1）直接滴定法用于碱性较强的生物碱,（2）剩余滴定法用于碱性较弱的生物碱,（3）酸滴定液返提后剩余滴定法用于对热不稳定的生物碱,1.碱化试剂最常用氨水2.提取溶剂（1）提取溶剂选择的原则（2）常用的提取溶剂最常用氯仿,（二）测定条件的选择,（3）提取溶剂的用量及提取次数通常应提取4次，第一次用量至少应为水液体积的一半，以后几次应各为第一次的一半,3.提取终点的确定用合适的沉淀反应确定,4.指示剂的选择,5.乳化的预防和消除,仪器简单、试剂常用，但操作繁琐、费时、精密度差、准确度差，主要用于制剂分析,（三）特点,阿片粉中吗啡的含量测定石灰法ChP（1995）,固相萃取离子对-反相高效液相色谱法ChP（2000）,（四）应用,（五）提取重量法,（一）基本原理在适当的pH介质中,三、酸性染料比色法制剂,1.水相中反应,离子对BH+In-被有机溶剂提取，使有机相呈色。剩余的酸性染料留于水相,3.比色法测定,2.有机溶剂提取,（1）定量分离出有机提取液，脱水后，测定A，求出有机碱含量,（2）定量分离出有机提取液，脱水后，碱化，则水相呈色，测定水相中In-的吸收度，间接求出有机碱的含量BH+In-+OH-B+H2O+In-,（3）定量分离出有机提取液，脱水后，酸化，则水相呈色，测定水相中HIn的吸收度，间接求出有机碱的含量,BH+In-+H+BH+HIn,1.水相的最适pH值如果水相pH值过小，酸性染料几乎仍以分子状态存在；如果水相pH值过大，则生物碱几乎全部以游离碱的形式存在,2.有机溶剂的选择CHCl3、CH2Cl2,（二）影响定量分析的因素,3.酸性染料的选择常用溴甲酚绿、溴麝香草酚蓝（BTB）等,5.有色杂质的排除,4.水分的影响严防水分的混入有机层可加入无水硫酸钠等脱水剂或经干燥滤纸滤过,6.共存物的影响,3.准确度差，不能用于原料药的测定，只能用于制剂分析,（三）特点,1.选择性高（选用适当pH缓冲液可消除干扰）,2.灵敏度高、供试品用量少,硫酸阿托品注射液ChP（2000）,注射液对照法,（四）应用,片剂对照法,五、色谱法,（一）高效液相色谱法,1反相HPLC分析生物碱类和有机含氮药物的特点色谱峰拖尾，保留时间过长，甚至长期地保留在色谱柱上。,四、紫外可见分光光度法,（1）加扫尾剂法分离依据物质的极性及溶解性。在流动相中加入扫尾剂，最常用的扫尾剂是三乙胺,（2）用硅胶作固定相法离子交换机理：根据pKa大小进行分离,2解决方法,流动相要选择适宜的pH值、竞争离子的种类和浓度，同时要加入有机改性剂适合于药物与体内代谢物的分析,（3）用金刚烷基硅烷化硅胶作固定相法分离依据物质溶解性,不论是游离碱还是其盐类，均是以游离碱出峰,（二）气相色谱法,97：83咖啡因和茶碱的特征鉴别反应是A.双缩脲反应B.Vitali反应C.Marquis反应D.紫脲酸铵反应E.绿奎宁反应,98：139盐酸吗啡中应检查的特殊杂质为A.吗啡B.阿朴吗啡C.罂粟碱D.莨菪碱E.其它生物碱,96：136用非水溶液滴定法测定盐酸吗啡含量时，应使用的试剂是A.5醋酸汞冰醋酸液B.盐酸C.冰醋酸D.二甲基甲酰胺E.高氯酸,97：130非水溶液滴定法测定硫酸奎宁含量的反应条件为A冰醋酸一醋酐为溶剂B.高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定C1mol的高氯酸与mol的硫酸奎宁反应D.仅用电位法指示终点E溴酚蓝为指示剂,99：78.非水溶液滴定法测定硫酸奎宁原料的含量时，可以用高氯酸直接滴定冰醋酸介质中的供试品，1摩尔硫酸奎宁需要消耗高氯酸的摩尔数为A.1B.2C.3D.4E.5,99x：116120滴定反应中A.被测物与HClO4的摩尔比为11B.被测物与HClO4的摩尔比为13C