专题5-课题3-血红蛋白的提取和分离

专题5课题3 血红蛋白的提取和分离导学案一、基础知识（一）凝胶色谱法 1、凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。2、凝胶实际上是一些微小的 球体，这些小球体大多数是由 构成的，如葡聚糖或琼脂糖。3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，即分子量大的分子先从层析中流出来。因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。思考1：如右图，a和b为大小不同的蛋白质，洗脱时，哪个先从层析柱中流出来？为什么？思考2：你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？（二）缓冲溶液1、缓冲溶液的作用是 。2、缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。如磷酸缓冲液（Na2HPO4/NaH2PO4）（三）电泳1、电泳是指 。2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 的差异以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。思考：带电荷越多，体积越小，迁移的速度是越快还是越慢？3、两种常用的电泳方法是 和 ，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于 。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：生理盐水洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时 分离红细胞，分离时采用 离心（500r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入五倍体积生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。注：为了防止血液凝固，要预先加入抗凝血剂_。思考3：兔成熟红细胞、鸡成熟红细胞，优先选哪种材料做实验？为什么？2、血红蛋白的释放：在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（2000r/min）后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是 的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。（二）粗分离：透析取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 （PH=7.0）中，透析12h。透析袋能使_自由进出，而大分子留在袋内。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的缓冲液。 （三）纯化凝胶色谱法进行分离纯化（四）纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定并进行相对分子质量测定思考4：与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这对蛋白质分离有什么意义？巩固练习1、利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来() A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子量小的 D.所代电荷多的2、蛋白质提取和分离分为哪几步() A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定3、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质() A路程较长，移动速度较慢 B. 路程较长，移动速度较快 C. 路程较短，移动速度较慢 D .路程较短，移动速度较快4、关于电泳的说法不正确的是() A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C蛋白质在电泳时的迁移率取决于它所带净电荷的多少 D带电荷一定情况下，分子量越大的蛋白质迁移速率一般越慢5、有关血红蛋白质提取和分离的说法，错误的是A、透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B、采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来C、离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离D、蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极方向移动6、有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是（ ）A、它们都是分离蛋白质的重要方法 B、它们的原理相同 C、使用凝胶色谱法需要使用缓冲液而电泳不需要D、凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量小的蛋白质先分离出来7、以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是（）A. 红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤三次B. 将血红蛋白溶液放在质量分数为O.9%的NaCl溶液透析12小时C. 凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在D. 蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢8、下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述中，正确的是（）A用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面杂蛋白B将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质C血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂D整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持pH基本不变和血红蛋白的结构9、下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其主要作用是_。我们通常选用猪、牛、羊等哺乳动物的血液进行实验，实验前取新鲜的血液，采血容器中要预先加入柠檬酸钠，取血后，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_(2)洗涤红细胞的目的是去除_，离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀。达不到分离红细胞的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的试剂是_(3)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。(4)甲装置用于_，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法,洗脱时，分子量小的蛋白质_(先/后)从凝胶柱中流出。(5)最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行_。10、红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：_、_、_和_。(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_。在样品处理中包括红细胞的洗涤、_、分离血红蛋白溶液、透析。洗涤红细胞的目的是_，你如何知道红细胞已洗涤干净？_分离红细胞时对离心速度和离心时间的要求是_若离心速度过高和时间过长结果会怎样？_。(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是_。透析的原理是_。(4)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是_。血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？_答案一 （一）1分配色谱法 相对分子质量的大小 2多孔 多糖类化合物 3较小 较长 较慢 凝胶外部 较短 较快 思考1 a思考2：如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱的次序，影响分离的效果。（二）1、在一定的范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液的pH的影响，维持PH基本不变。2、1-2种缓冲剂（三）1指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2 正电或负电 相反 带电性质 形状 大小 迁移速度 3琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分子大小 二 样品处理 、 粗分离、纯化、纯度鉴定（一）1去除杂质 低速 黄色血浆 红细胞液体 上清不再呈现黄色 柠檬酸钠思考3：兔成熟红细胞 没有细胞核和众多细胞器，杂质少，有利于血红蛋白分离2蒸馏水 甲苯 3甲苯层 脂溶性物质的沉淀层 血红蛋白的水溶液 其他杂质 （二）透析袋 磷酸缓冲液 小分子 分子量较小思考4：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。巩固练习1A 2C 3D 4C 5D 6A 7C 8D9(1)运输血液中的O2和CO2 防止血液凝固 （2）杂蛋白（血浆蛋白） 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯 (3)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白(4)透析(粗分离) 去除样品中分子量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 后 (5)纯度鉴定10、(1)样品处理粗分离纯化纯度鉴定 (2)防止血液凝固血红蛋白的释放去除杂蛋白离心后的上清液没有黄色低速短时间离心，如500