第二章：分子克隆的工具酶..ppt

第二章分子克隆工具酶,切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质,任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统,限制性内切酶修饰酶,第一节限制性内切酶,Restrictionendonuclease,一、限制与修饰Restrictionandmodification,50年代初，发现hostcontrolledspecificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。,E.coliKE.coliBE.coliC,KBC,E.coliKE.coliBE.coliC,KBC,1,1,1,10-4,10-4,10-4,10-4,1,1,说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：AN6甲基-腺膘呤C5甲基-胞嘧啶,2.限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶,需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点远离识别位点1000bp以上,1970年美国约翰霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA即HindII酶,5.GTPyPuAC.33CAPuPyTG.5,GTCGACGTTAACGTCAACGTTGAC,YR,Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤,5.GAATTC.33CTTAAG.5,EcoRI,3.限制酶的命名,宿主属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号序号罗马字HindIIEcoRI,例如：HindHaemophilusinfluenzae（流感嗜血杆菌），：表示菌系为型血清型；：表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichiacoliRIEcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上HindHaemophilusinfluensaedSacI(II)StreptomycesachromogenesI(),第类酶（切割部位无特异性）：如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg+等辅助因子,第类酶（切割部位有特异性）：如EcoRI(大肠杆菌)、Hind(嗜血杆菌)，分子量较小(约20000-100000)，作用时需Mg+存在,4、限制性内切酶的分类：,III类识别位点严格专一（不是回文序列）：切点不专一，往往不在识别位点内部。,NEB；Invitrogen公司；promega普洛麦格；TakaRa.,二、限制酶的识别序列,2、识别特定碱基顺序：2、1回文对称序列（palindrome，从两个方向阅读其序列相同的序列）。,1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。,4碱基酶识别位点在DNA分子中的频率6碱基酶稀有切割限制酶,R=AorGY=CorTM=AorCK=GorTS=CorGW=AorTH=AorCorTB=CorGorTV=AorCorGD=AorGorTN=AorCorGorT,EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5,3、型限制性核酸内切酶的切割方式切点大多数在识别顺序之内限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-,CCTCAGCGGAGTCGBbvcI,三、限制酶产生的末端种类1.粘性末端）-端突起，）-端突起，个数为或个核苷酸,2.平末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIIIGGCCEcoRVGATATCXmnIGAANNNNTTC,3.非对称突出端来自非对称识别序列CCTCAGCBbvCIGGAGTCG,简并序列AccIGT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC,间隔序列DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG,4.同裂酶1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG,同序同切这些酶识别序列和切割位置都相同HindIIHincIIGTY/RACHpaIIHapIIC/CGGMobISau3AI/GATC,同序异切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACCAatIIGACGT/CBsaHIGR/CGYC,识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同,“同功多位”EcoRIG/AATTCApoIR/AATTYHpaIGTT/AACHincIIGTY/RAC,许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoR识别和切割位点为GAATTC，Apo识别和切割位点为RAATTY，后者可识别前者的序列。,其它SalIG/TCGACAccIGT/MKACHincIIGTY/RAC,许多不同的限制酶来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接。,5、同尾酶（isocaudamer）：,GATC4个核苷酸组成的粘性末端,平端同裂酶,四、DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。,双酶切PCR产物,2hr20hrAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%EcoRIGGAATTCC9090,PstIGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG(N)149090CTGCAG(N)2000,1、保护碱基,限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。,PCR引物设计时，为保护5端外加的内切酶识别位点，使酶切完全而添加.,比如设计引物5端导入酶切位点的时候,一般导入34个;导入的碱基,最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5形成所谓GCClamp(有的软件,认为这样好).别的就没什么了.,加几个和加哪几个的问题,载体的酶切位点也会碰到，相临的2个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI,XhoI:1EcoRI100%PstI:1EcoRI88%,五、位点偏爱(sitepreferences),单位酶:在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA完全消化所需的酶量,DNA,某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。,*1975EcoRI切割phage(Lambda)中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。,1.现象,*有4个SacII位点三个在中央一个在右臂（Right-terminus）at40,386中央三个快50倍,NEB检测了许多限制酶，有许多酶的差异在10倍的范围上，但有许多酶有较大的差异,如NarI,NaeISacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG,(1)pBR322含4个NarI位点1单位酶1hr(标准条件)将两个位点完全切割但是另外两个位点50单位,16小时不能完全切割完全,(2)NaeI在pBR322也有4个位点，其中两个易切割，有一个有点慢,第四个慢50倍。,在DNA上NarI和NaeI各都有一个位点，但是过量的酶只能完成部分酶切。,2.原因,(1)在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用,plasmid,Plasmid/SalI,Plasmid/EagI,六、酶切反应条件,任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件,(一)缓冲液,1.常规缓冲液,pH,Mg+,DTT,BSA(10X),Mg2+的作用是提供二价的阳离子。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。,pH7.0-7.9(at25)Tris-HCl,乙酸Tris-HCL的作用在于，使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。离子强度：NaCl,高中低100mM50mM0,Mg+10mMMgCl2,MgAcDTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)1mM100g/mlBSA少数需要,不同酶具有不同Buffer,各公司设立几种常用Buffer,NEBuffer1NEBuffer2NEBuffer3NEBuffer4,BufferABufferBBufferHBufferL,Roche,对DNA进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）。,2.通用缓冲体系Phamacia法玛西亚One-Phor-Allbufferplus,OPA+,3.注意事项a.取少量酶(方法or稀释)b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积d.反应时间的延长e.分装（对于多个反应）,(二)反应温度大多数为37一部分为50-65少数25-30高温作用酶于37时活性多数10-50%TaqI(65)10%,ApoI(50)50%,(三)反应时间1hrormore许多酶延长其反应时间可减少酶的用量16hrEcoRI0.13(1/8)HindIII(1/8),KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1),(四)反应终止EDTA终10mMEDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应2.加热37酶6520minotherwise8020min,不失活在8020min的酶,37：Bg1IIHpaIPvuII65：Tth111ITspRI50：Bc1I,3.其它DNA纯化(苯酚,试剂盒),七、星星活性(staractivity),非特异性切割,在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性,1.概念,实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。,ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI,2.酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关最普遍的活性变化1个碱基的变化识别位点外层碱基的随意性以及单链缺口,3.引起星星活性的因素高浓度甘油（5%）酶过量（100U/g）低离子强度（pH8.0),有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane用其它二价阳离子代替Mg+Mn+，Cu+，Co+,Zn+,不同的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感但后者对甘油浓度更敏感,星星活性在绝大多数情况下，是可控制的,4.抑制星星活性的条件（措施）减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶济或乙醇提高离子强度到100150mM(如果不会抑制的话)降低反应pH至pH7.0使用Mg+作为二价阳离子,1.外因外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。,九、影响活性的因素,2.“内因”位点偏爱性甲基化底物的构象,构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割DNA相比，EcoR、Pst、Sal需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA。PaeRT与Xho切割相同的序列（CTCGAG），但如果5端为CT则PaeRT不能切割。,十、酶切位点的引入（酶切水平）,1.产生的5突出端补平后连接EcoRIGAATTCCTTAAG,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,AATT,TTAA,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,AATT,TTAA,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,AATT,TTAA,AceIATTAAT,XmaIGAANNNNTTC,2.同尾末端的连接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)AlwI(GGATC4/5),3.平端连接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)MobI(GATC),十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性,GC%,酶切位点出现的机率,BamHIGGATCC,EcoRIGAATTC,在基因组中，碱基对的排列是非均匀的因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb,细菌基因组在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少酵母基因组G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNAorTyelements)，富含G+C的识别序列就特别少,哺乳动物细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的,第二节甲基化酶Methylase,Methylation,methyltransferase,一、甲基化酶的种类,在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，,在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶,1.Dam甲基化酶,GATC腺嘌呤N6位置引入甲基,PvuIIBamHIBclIBglIIXhoIIMboISau3AI识别位点中含GATC序列ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列,有些限制酶对Dam甲基化敏感不能切割相应的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI等不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等,一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-E.coli中提取DNA,2.Dcm甲基化酶,识别CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,EcoRII/BstNICCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受dcm甲基化作用影响BstNI可避免这一影响,受影响酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等,不受影响酶有：KpnIGGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等,二、甲基化对限制酶切的影响,1.修饰酶切位点,HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAAC,M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割,BamHIGGATCCM.MspIm5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割,构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNA用M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割,2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCTTaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*AGCT*AGCTDpnI,第三节DNA聚合酶,DNApolymerase,催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性,真核细胞有4种DNApoly：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出提出，与细胞增生无关。：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。,原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关I单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长II与低分子脱氧核苷酸链的延长有关III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶,一、大肠杆菌DNA聚合酶IEcoliDNApolymeraseI,1.活性,单链多肽(109kDa)三种活性,53DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（带3OH基）或5突出DsDNA,Mg2+dNTPDNApolyI,53外切核酸酶活性底物:dsDNAorDNA:RNA杂交体活性：从5端降解dsDNA，也降解RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性),Mg2+DNApolyI,+dNTP,35外切酶活性底物：3-OHdsDNAorssDNA活性：从3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封闭。,Mg2+DNApolyI,+dNTP,Mg2+DNApolyI,+dNTP,Proofreading,反应平衡,过量dNTP平端,2.用途切口平移法标记DNA,Nicktranslation,（所有DNApoly中只有此有此活性）,Mg2+,低限量DNaseI,dNTPDNApolyI,产生切口,切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移,若有放射性dNTP,则可标记成探针,用于cDNA克隆中的第二链即单纯的DNA聚合活性但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶,末端标记（交换或置换反应）,Mg2+,DNApolyI-P32dATP,A*T,T4DNApolyT7DNApoly更好,二、Klenow酶,E.coliDNApolymeraseIlargefragmentKlenowfragment,在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响，或基因工程而得76kDa,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段,Klenow聚合酶或Klenow大片段酶,大肠杆菌DNA聚合酶,DNA聚合酶全酶,具有53的聚合活性和35核酸外切酶活性，,53的核酸外切酶活性,1.活性共两种,同DNApolyI,2.作用补平3凹端，注意要用dNTP抹平3凸端，注意必须加足量dNTPT4和T7具更强3-5外切活性。末端标记A置换反应同前,同样被T4poly代替B补平3-凹端的过程进行标记,cDNA克隆中合成第二链随机引物标记DNA测序（Sanger双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。PCR反应被Taq等取代在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA,仅利用DNA合成活性,三、T4噬菌体DNA聚合酶,T4DNApolymerase,来源于T4phage感染的E.coli114kDa,1.活性由噬菌体基因编码的，具有两种酶催活性，即53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。与Klenow酶相似，但35外切活性强200倍,2.用途补平或标记3凹端必须有高浓度dNTP（末端标记）置换反应必须有高浓度dNTP(一种)末端标记,标记DNA片段即利用外切活性产生了3凹端再补平（用标记的dNTP）,T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段,四、T7噬菌体DNA聚合酶,T7DNApolymerase,来源于T7phage感染的E.coli为两种紧密结合的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白),T7DNApoly为持续合成能力最强的一个平均长度要大得多,在测序时具有优势活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似但35外切活性为Klenow的1000倍用途:A.替代T4的功能B.长模板的引物延伸,修饰的T7DNApolymerase99%35外切活性被除去（V1.0）完全除去（V2.0）用于测序反应（测序酶）SequenaseUSBBiochemical,1.特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性2.用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4106倍DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95)与DNA引物退火(45)引物延伸(75),五.TaqDNA聚合酶耐热DNA聚合酶,六、反转录酶Reversetranscriptase,依赖于RNA的DNA聚合酶,1种类来自AMV禽成髓细胞瘤病毒Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒,53合成DNA无35外切活性,AMV二链多肽(62kDa/94kDa)具53DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA),在反应开始时,引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争,反应终止时，RNaseH可在正在增长的DNA链近3端切割模板趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度但在42(鸡的正常体温),能有效发挥DNA合成作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA早期提纯过程中易被内切酶污染,cDNA不超过1kb,现已解决,HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit是用于从TotalRNA或mRNA高保真合成cDNA的2StepRT-PCR试剂盒。反转录反应使用了TaKaRa独自开发的反转录酶PrimeScriptRTase，该酶是一种新型的RNaseH-型反转录酶，无RNaseH活性，不会分解模板RNA，能够有效合成长链的1st-strandcDNA。本反转录酶具有极强的延伸能力，即使对有复杂二级结构的RNA，在42条件下也能得到良好的反应效果，无需进行高温反转录反应，因为高温的反转录反应会导致RNA的降解。PCR反应选用兼具高保真和高效扩增性能的PrimeSTARHSDNAPolymerase，可以很好地应用于cDNA克隆等对保真性要求高的实验。使用本试剂盒扩增得到的PCR产物几乎都为平滑末端，可克隆于平滑末端的载体中。,M-MuLVM-MLV逆转录酶是一种依赖于RNA和DNA的DNA聚合酶。它可以单链RNA、DNA或RNA-DNA杂合链为模板，以RNA或DNA为引物启动DNA合成。该酶带有针对RNA-DNA杂合链中RNA的RNaseH活性。本产品来源于带有编码莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶的pol基因片段的E.coli菌株。单肽84kDaRNaseH活性弱利于合成较长cDNA,2用途cDNA克隆测转录起始点（引物延伸法）5突出DNA的补平测序反应(当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时)其它RT-PCRRNA二级结构,3.活性53DNA聚合活性（Mg+）RNAorDNA模板及带3OH的RNA或DNA引物RNaseH活性,RNaseH-突变,4.注意事项无35外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。单链拷贝，也可双链合成（自身序列为引物，但效率低）,50g/ml放线菌毒D，抑制第二链合成。,七、末端转移酶,来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端T,C首选Co2+A,G首选Mg2+,Terminaltransferase,1.底物DNA,可短至3个核苷酸,3突出低离子强度时,平端或3凹出端DNA亦可但效率低2.用途在3端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记末端标记ddNTP(标记的),3715min随时间的延长尾亦长。,3.同尾的长度,第四节RNA聚合酶,RNApolymerase,来源于噬菌体感染宿主后所产生,SP6噬菌体聚合酶来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株T3或T7噬菌体聚合酶来源于感染的大肠杆菌,1.活性这些RNA聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物，但识别特异性位点,2.用途体外：将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体,如pGEM-3Z载体(2.74kb,p13)中，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA，从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA，体外剪接反应的底物,体内：用于表达外源基因A.Ecoli先构建宿主菌，将T7polyRNA基因置于lacUV5启动子之下，插入到噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶原菌,EcoliBL21(DE3)：lacUV5启动子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌体DE3区，该区整合于染色体的BL21处。,若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中在IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导启动外源基因的表达,另一种方法是，先导入重组质粒，再用（带T7RNApoly）感染，激活目的基因的表达,B酵母菌酵母启动子+T7RNApolyin稳定载体T7启动+外源基因in另一载体,第五节连结酶(Ligase),将两段核酸连接起来的酶,1.T4DNAligase68kDaT4噬菌体感染大肠杆菌产生,催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二脂键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。,ATP+DNAligase(E)E-AMP+PPi。E-AMP上的AMP转移到DNA的5磷酸根上，使其活化，释放出酶。活化的5磷酸根与相邻的3羟基形成3，5磷酸二酯键，并释放出AMP。,底物：DNAorRNA(效率低)粘端，切口，平端影响因素：PEG（低浓度）10%单价阳离子（150-200mMNaCl）提高平端连接速率,Weiss单位在37下20min催化1nmol32p从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量。,NEB单位(NewEnglandBiolabs)20l,16,30min,300g/ml(0.12M5末端)/HindIII连接50%所需的酶量,/HindIII(7个切点)23.1(kb)9.46.64.42.32.0564(bp)125,48502bp,1Weiss=67粘端连接单位(NEB单位)(Molecularcloning写为60NEBunit),1NEB单位=0.015Weiss单位,条件164hr4overnight需ATP,5min连接T4DNAligaseRoomtemperature(BoehringerMeinnham公司),平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接)。加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。加入单价阳离子(NaCl),最终浓度150-200mmol/L。,2.E.coliDNA连接酶与T4DNAligase相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与平端连接效率低，用于置换合成法作cDNA克隆（不将RNA连接到DNA,不连接RNA）,第六节核酸酶(nuclease),一、BAL31核酸酶来源于AlteromonasespejianaBAL3主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去掉除单核苷酸，还是一个内切核酸(单链，nick,gap)依赖Ca+EGTA可抑制活性,连续去除3端单核苷酸后形成的单链DNA，可被内切核酸活性降解,用途：从两头缩短DNA(用于缺失突变等），活性发挥均匀，活性与酶浓度成线性关系确定DNA二级结构DNA限制酶切图,注：可能有单链突出，可用DNApoly补平，单链突出的长度与酶浓度有关，如：2-5u/ml,平均有5个bases单链，10-20%保持平端,二、Sl核酸酶来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸对dsDNA，dsRNA；DNA:RNA不敏感酶量大可完全消化双链，中量，可在切口或小缺口处切割双链作用：用于分析DNA:RNA杂交体的结构去掉突出的单链尾，以产生平端打开双链cDNA合成中产生的发荚环,三、绿豆核酸酶MungBeanNuclease来源于绿豆芽与Slnuclease相似但比Sl更温和在大切口上才切割可使DNA突出端变成平端,CCAAGCTTGGGGTTCGAACC,CCAAGCTTGGGGTTCGAACC,CCATGGGGTACC,HindIII,MBN,CCATGGGGTACC,NcoI,四、核糖核酸酶ARNaseA（来源于牛胰）内切核酸酶可特异攻击RNA上嘧啶残基的3端形成带嘧啶3磷酸的单核苷酸或末端带嘧啶3磷酸的寡核苷酸,用途：除去DNA样品中的RNA除去DNA:RNA中未杂交的RNA区确定杂交体DNA的RNA中单突变的位置可能污染其它酶（如DNA酶）使用前应加热,五、DNaseI(来源于牛胰)内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解dsorssDNAMg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA产生平端或1-2个核苷酸突出,用途：切口平移标记，在dsDNA上随机产生切口在闭环DNA上引入单切口以使分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）建立随机克隆，以便安插在M13phage上测序分析蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法）除去RNA样品中的DNA（RNase-free）,六、外切核酸酶III（来源于大肠杆菌）exonucleaseIII,ExoIII.活性催化从dsDNA3-OH逐一去除单核苷酸底物为dsDNA线状或带切口或缺口的环状DNA，结果是在dsDNA上产生长的单链区。无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性,RNAaseH活性3-磷酸酶活性(去磷酸),但不降解磷酸二脂链,不降解单链DNA及3突出dsDNA持续作用能力不强，产物为长短不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。,2用途：制备部分截短的DNA,用作探针（Klenow补平）,类似T4poly的作用在dsDNA链上产生末端序列嵌套缺失的成套缺失体一般与绿豆核酸酶或Sl核酸酶联合应用也能制备单向缺失的DNA（如另一端为3突