液相色谱法附录III D BP2010、2011

附录附录 III D 液相色谱法 BP2008 液相色谱法是基于各组分在互不相溶的两相中的分配差异，组分随液体流动相 在含固定相的色谱柱中分离的色谱技术。流动相为通过嵌有固定相色谱柱进行 渗透的液体。液相色谱法是基于质量分布、吸附机理，离子交换，分子筛或者 立体化学的相互作用等机理来完成的。 仪器装备仪器装备 装备系统由泵系统，进样器，色谱柱（可能会有柱温控制器），检测器和数据 采集系统（积分仪或图形记录仪），流动相通常是由一个或几个储液瓶提供， 以恒定的流速经色谱柱后进入检测器。 泵系统泵系统 液相色谱的泵系统是以恒定的速率传送流动相的装置，将压力脉动设至最小， 例如采用加压溶剂流过脉冲抑制装置的方法。管道和连接系统能够抵挡来自泵 系统的压力，液相色谱泵应配备一个渗出气泡的装置。 控制面板能够通过一个设置好的程序精确地传送恒定（等度洗脱）或变化组分 的（梯度洗脱）的流动相。梯度洗脱时，泵系统可以从几个储液瓶中传送溶剂， 同时在泵的高压或低压都能够很好的混合溶剂。 进样器进样器 样本溶液通过能够在高压操作的进样系统，在色谱柱的顶端或接近顶端处将液 体注入流动的流动相中。进样器可为手动或自动的固定环或可变容积装置。局 部手动进样环可能会降低注射体积精度。 固定相固定相 液相色谱中有许多不同类型的固定相，包括： 二氧化硅，氧化铝或固体石墨，应用于基于吸附原理或质量分布原理来达 到分离效果的正相色谱。 具有酸碱集团的树脂或高分子聚合物，应用于离子交换色谱，是基于流动 相中不同离子的竞争原理来进行分离的。 多孔性二氧化硅或聚合物，应用于排阻色谱，是基于分子容量的不同（与 立体排斥类似）的原理来进行分离的。 在高分子，硅胶或多孔石墨的基础上进行不同的化学分子修饰，应用于反 相液相色谱，是基于流动相和固定相的不同微粒的原理进行分离的。 特殊化学修饰的固定相，如纤维素，直链淀粉衍生物，蛋白质或多肽类物 质环糊精等，利用对映体进行分离（手性色谱）。 大多数分离技术是基于以经过化学修饰的硅作为固定相，以极性溶剂作为流动 欢迎下载2 相的分离机制，载体的表面活性，例如，有硅醇聚合的二氧化硅，可以和各种 硅烷试剂反应产生有许多活性部位的甲基硅烷衍生体的共价载体表面。键合相 是决定色谱系统分离性能的一个重要的参数。 通用的键合相如下所示： 辛基 = Si-(CH2)7-CH3 C8 十八基 = Si-(CH2)17-CH3 C18 苯基 = Si-(CH2)n - (C6H5) C6H5 氰丙基 = Si-(CH2)3-CN CN 氨丙基 = Si-(CH2)3-NH2 NH2 二醇 = Si-(CH2)3-O-CH(OH)-CH2-OH 除非是生产厂商规定，硅基反相色谱柱在明显变化的 PH2.08.0 范围内的流动 相中是稳定的。含有多孔石墨或高分子材料微粒如苯乙烯二乙烯苯共聚物的色 谱柱在一个很大 PH 范围内是稳定的。在某些情况下，可用以未修饰的二氧化 硅，多孔石墨或者极性的经过化学修饰的如氰丙基或二醇修饰的硅为固定相， 非极性的溶剂为流动相的正相色谱进行分析。 对于分析分离技术，最常用固定相的粒径为 3m10m，颗粒可能是球形的或 不规则的，具有多孔隙度或不同的比表面积。这些参数有助于一些特殊固定相 的色谱分析。对于反相色谱，固定相键合的程度可用连接的碳的数量来表示， 并增加是否在末端包覆（残留的硅醇团为甲烷硅基化的）的测定因素。当存在 残余硅醇基时，可能会出现峰的拖尾现象，尤其是基质峰。 除非在论著中有特别的说明，色谱柱一般是不锈钢做成的，分析性色谱的色谱 柱的长度和内直径是可变的，内直径小于 2mm 的色谱柱常称为微径柱，分析时 流动相和色谱柱必须保持恒温。大部分分离都在室温下完成，但是色谱柱会被 加热以获得更高的效率。由于温度过高固定相的性能会退化或改变而使流动相 的组成发生变化，故而建议色谱柱加热温度不超过 60C。 流动相流动相 对于正相层析，可用弱极性溶剂，流动相应严格控水，使实验结果获得较好的 重现性。在反相液相色谱中，可用有机修饰或未修饰的含水流动相。 流动相的组成部分通常会被过滤以去除大于 0.45m 的粒子，多组分的流动相通 欢迎下载3 过测定各组分的体积（除非有具体的重量），再混合制得。或者溶剂通过配比 阀控制泵来输送根据预期的比例混合的液体。溶剂在通过泵之前应先用氮气鼓 泡，超声处理脱气，或利用在线膜/真空模块防止探测池内产生气泡。用于流动 相制剂的溶剂，通常不会使用稳定剂，在紫外光检测器的检测波长下是透明的， 所用溶剂和其它组分质量适宜。调节值，如果有必要的话，只用流动相中 水性的组分而不用混合物，如果用缓冲液，利用水和经过有机修饰的流动相的 混合物充分清洗系统，防止色谱结束后盐类结晶。 流动相可能包含其它组分，例如，对层析法的抗衡离子或者用于非手性固定相 的色谱分析的一个手性选择器。 检测器检测器 紫外可见分光光度计，包括二极管阵列检测器，是最常应用的检测器，荧光 分光光度计，差示折光器，电化学检测器，质谱仪，光散射检测器，放射性检 测器或其它特定的检测器也会用得到。 方法方法 在室温或论著中指定的温度下利用规定的流动相和流速来平衡色谱柱，直至一 个稳定的基线产生。制备检测物质的溶液（）和规定的参照溶液（），液 体必须出去固体颗粒。 英国药典个论补充英国药典个论补充 在论著中流动相的组分和流速都有明确规定，利用真空泵向流动相混合溶剂中 充气，或者用其他不会影响流动相混合组分的合适的充气方法。 在定量的工作中，特别是内部标准在论著中没有具体的说明，固定体积的回环 注射器可以被应用，在某些特殊的例子中论著中会规定具体的峰高，此时对称 因子的峰高不予考虑。 色谱柱通常是不锈钢的，它的尺寸在论著中有规定，尺寸描述为内部直径长度， 当论著中用特定的字母规定固定相的作用，那么其他相关的固定相的定义也就 可以能推测出来了，固定相的标称直径紧跟在特定的字母后面用圆括号标示。 在大多数情况下，参照标准在某种意义上说已经成为一种特定的商业品牌，但 是此陈述并不意味着有不同然而等效商业品牌却不得使用，分离必须在恒周温 度下进行，除非在论著中有特别的说明，当使用二氧化硅填充的色谱柱且在一 个较高的值下使用流动相时，在分析柱之前使用前柱是比较恰当的。 除非在论著中有具体的规定，检测器包含一个配有低流量流通池（大约 ）的光度检测器，波长设置在论著中有具体的说明。 特殊光谱仪的设计需要修改条件这在论著中有详细的说明，在这种情况下分析 者应该使修改条件产生可对照的结果。 欢迎下载4 进样量进样量 在论著中进样体积没有详细的说明，分析者应当根据具体应用选择合适的体积。 进样体积的选择应根据分析物的反应，探测器的使用情况，色谱柱的效率和色 谱系统的整体性能，当没有标明进样体积时，通常选择，这应该在当地 的操作条件下验证其适用性。 运行时间运行时间 个论中没有规定运行时间。分析者使用时应根据样品选择适宜的运行时间。根 据试验类型选择运行时间。例如，在相关物质试验中没有指定运行时间，分析 者应确保运行时间大于所有已知或可能出现的次峰的出