HIS镍柱纯化方法

纯化前准备1. 推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。2. 避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂。3. 若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M盐酸胍或8 M尿素4. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等5. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；6. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；7. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9. 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染注：1. 包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析2. 除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH值法等可被应用，详见说明书Binding buffer 中咪唑的浓度在洗涤时所用的Binding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。Buffer 的准备所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45m滤膜过滤。所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低。推荐 buffer （使用前用0.45 m filter过滤）Binding buffer：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 20- 40 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 500 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）1. 样品准备 样品需被充分溶解。过柱前经0.45 m滤膜过滤。样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。2. 重力纯化法 Ni-NTA Column 准备 1. 温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(510 minutes)或低速离心(5 minute at 500 g)，轻柔的吸出上清。3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心 5 minute at 500 g，轻柔的吸出上清。4. 用bingding buffer 重复第3步。5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurryNi柱子的beads浸泡在20% ethanol中，倾除20% ethanol溶液，用蒸馏水将beats调成75%（v/v）的浓浆状的凝胶。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，静置。3. 样品与Ni 柱结合1. 每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白2. 将混合物室温，低速振荡孵育1h4. Buffer 洗涤及洗脱1. 离心 5 minute at 500 g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4 for SDS-PAGE analysis。2. 用1 ml Binding Buffer洗涤柱子，在摇床上温和的振荡2min，然后低速离心 5 minute at 500 g ，小心吸出上清，重复该步一次。上清保存放在4C for SDS-PAGE analysis。3. 用0.5 ml Elution buffer洗脱柱子，方法同4。重复该步三次。分管收集4次洗脱液，存放在4C for SDS-PAGE analysis。纯化柱的再生： 如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重复使用57次。1. 用5倍柱体积的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸盐，0.5 M NaCl pH 7.4的buffer 洗涤柱子，洗去螯合的镍离子。2. 用5倍柱体积的binding buffer洗涤柱子3. 用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子4. 用0.5倍柱体积的含0.1 M 的NiSO4的无菌水溶液装填5. 用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子6. 用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子7. 加入20的乙醇4-30长期保存。lysis buffer中加咪唑的目的是与杂蛋白竞争，使那些与填料亲和力弱的杂蛋白不能挂柱；wash buffer中加咪唑是为了洗去大部分已挂柱的杂蛋白（也会洗去少量目的蛋白）；elution buffer中加梯度咪唑，而且咪唑浓度渐高，是咪唑和目的蛋白竞争性结合填料，从而把目的蛋白从柱上洗脱。层析柱再生1. 除镍 10倍柱床体积的stripping buffer洗柱，1ml/min 10倍柱床体积的binding buffer洗柱，1ml/min (可省) 10倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min2. 除去柱上残余蛋白 1M NaOH充满柱并保持2h 10倍柱床体积的binding buffer洗柱，1ml/min (可省) 10倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min3. 挂镍 0.5倍柱床体积的0.1NiSO4洗柱，1ml/min 5倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min 5倍柱床体积的binding buffer洗柱，1ml/min4. 20%乙醇过柱，4保存注： stripping buffer：2 mM Na3PO4 0.5 M NaCl 50 mM Na2EDTA pH 7.4 蛋白纯化Elution buffer 洗柱 10倍柱床体积的binding buffer平衡 样品过滤，上样（关阀门，15min） 10倍柱床体积的binding buffer洗柱 Elution buffer 洗脱蛋白（一般蛋白位于前5ml） 超滤管10000rpm，浓缩离心10min注： 500mlBinding buffer：20 mM Na3PO4 2010-30.5380.16=3.8g 0.5 M NaCl 0.50.558.5=14.625g 5mM 咪唑 510-30.568.09=0.17gpH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖