化妆品32种禁限用染料成分的检测方法和编制说明

- 1 - 附件 2： 化妆品中 32 种禁限用染料成分的检测方法 1 范围 本方法规定了测定染发类化妆品中 32 种禁限用染料成分（见附录 A）的高效液相色谱 法。 本方法适用于染发类化妆品中 32 种禁限用染料成分的含量测定。本方法无法区分所涉 及染料成分的游离态、硫酸盐和盐酸盐，化妆品中各种形态同时存在时，应换算成一种形 态，以总量表示。 2 原理 用无水乙醇+水=1+1 的混合溶液提取染发类化妆品中的 32 中禁限用染料成分，用高效 液相色谱仪进行分析，以保留时间和紫外吸收光谱定性，峰面积定量。本方法中 32 种禁限 用染料成分的检出限、定量下限及取 0.5g 样品时的检出浓度及最低定量浓度见表 1。 表 1 32 种禁限用染料成分的检出限、检出浓度、定量下限、最低定量浓度 序号 附录 A 中编号物质名称 检出限/ g 检出浓度 /（g/g） 定量下限/ g 最低定量浓度 /（g/g） 131,5-萘二酚5.010-3201.510-260 251-萘酚3.010-3121.010-240 382,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl8.010-3322.510-2100 4102,6-二氨基吡啶1.510-2605.010-2200 5132,7-萘二酚3.010-3121.010-240 6152-氨基-3-羟基吡啶1.310-2524.010-2160 7212-氯-p-苯二胺硫酸盐1.510-2605.010-2200 8242-甲基雷琐辛1.310-2524.010-2160 9252-硝基-p-苯二胺5.010-3201.510-260 - 2 - 序号 附录 A 中编号物质名称 检出限/ g 检出浓度 /（g/g） 定量下限/ g 最低定量浓度 /（g/g） 10314-氨基-2-羟基甲苯6.510-3262.010-280 11324-氨基-3-硝基苯酚6.510-3262.010-280 12334-氨基-m-甲酚8.010-3322.510-2100 13344-氯雷琐辛5.010-3201.510-260 14364-硝基-o-苯二胺1.510-2605.010-2200 15406-氨基-m-甲酚1.010-2403.010-2120 16426-羟基吲哚3.010-3121.010-240 1761氢醌3.010-3121.010-240 1867m-氨基苯酚6.510-3262.010-280 1970m-苯二胺8.010-3322.510-2100 2072N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐2.510-21007.510-2300 2173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐2.510-21007.510-2300 2274N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl2.010-2806.010-2240 2378N-苯基-p-苯二胺2.510-3108.010-332 2481o-氨基苯酚6.510-3262.010-280 2583p-氨基苯酚6.510-3262.010-280 2685苯基甲基吡唑啉酮2.010-2806.010-2240 2787p-甲基氨基苯酚硫酸盐1.010-2403.010-2120 2888p-苯二胺1.210-2483.510-2140 2991间苯二酚8.010-3322.510-2100 - 3 - 序号 附录 A 中编号物质名称 检出限/ g 检出浓度 /（g/g） 定量下限/ g 最低定量浓度 /（g/g） 3095甲苯-2,5-二胺硫酸盐2.010-2806.010-2240 3196甲苯-3,4-二胺8.010-3322.510-2100 32OPDo-苯二胺8.010-3322.510-2100 3 试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为超纯水。 3.1 无水乙醇。 3.2 甲醇，色谱纯。 3.3 乙腈，色谱纯。 3.4 亚硫酸氢钠。 3.5 磷酸溶液（1+9）：吸取磷酸（20=1.69g/mL）10mL，加水 90mL。 3.6 磷酸盐混合溶液：称取十二水合磷酸氢二钠 1.8g、磷酸二氢钾 2.8g 和庚烷磺酸钠 （C7H15SO3Na）1.0g，用水稀释至 1L，混匀，配制成含庚烷磺酸钠（1g/L）的磷酸盐缓冲液， 加入磷酸溶液（3.5） ，调节 pH 至 6.0 左右，0.45m 微孔滤膜过滤。 3.7 染料类化合物标准储备溶液（染料成分）=10g/L）：称取染料对照品约 100mg（精确至 0.1mg）于 10mL 容量瓶中，以 2g/L 亚硫酸氢钠水溶液 + 无水乙醇（3.1） =1+1 的混合溶液定容至 10mL，配成约 10g/L 的单标溶液。以下几种物质在上述溶剂中的溶 解性较差，分别采取如下措施：甲苯-2,5-二胺硫酸盐和 2-氯-p-苯二胺硫酸盐 2 种物质直接 用 2g/L 亚硫酸氢钠水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺直接用无水乙醇（3.1）定容；2-硝基- p-苯二胺和 4-硝基-o-苯二胺需将称样量减至 25mg，再用无水乙醇（3.1）定容，配成约 2.5g/L 的单标溶液。储备液保存于 04冰箱中，最多使用 2 天。 4 仪器和设备 4.1 高效液相色谱仪，具有二极管阵列检测器。 4.2 pH 计。 4.3 超声波清洗器。 4.4 离心机。 - 4 - 5 分析步骤 5.1 样品预处理样品预处理 称取样品约 0.5g（精确至 1mg）于 10mL 具塞比色管中，加无水乙醇（3.1）+ 水=1+1 的混合溶液至刻度，超声提取 15min。超声过程中，若水温高于 40应停置降温，冷却后 继续超声，直至样品溶液完全均一化。浑浊溶液可取适量高速离心，取上清液经 0.45m 微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液，并尽快测定。 5.2 测定测定 5.2.1 色谱参考条件 色谱柱：Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16柱（250mm4.6mm，5m）或等同柱； 色谱保护柱：Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16保护柱（20mm4.0mm，5m）或等同 柱； 流动相 1：乙腈（3.3）+ 磷酸盐混合溶液（3.6）=10 + 90； 流动相 2：甲醇（3.2）+ 磷酸盐混合溶液（3.6）=10 + 90； 流动相 3：乙腈（3.3）+ 磷酸盐混合溶液（3.6）=40 + 60； 流量：1.0mL/min； 检测器：二极管阵列检测器； 检测波长：280nm； 柱温：25。 5.2.2 校准曲线的制备 参照色谱图 1色谱图 3，对 32 种禁限用染料成分进行分组，并根据分组情况，分别移 取适量染料类化合物标准储备溶液（3.7）于 10mL 容量瓶中，用无水乙醇（3.1）稀释至刻 度，配成 500mg/L 的混合标准溶液。各取混合标准溶液适量，用无水乙醇（3.1）稀释，配 成 10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L 共 6 个浓度的混合标准系列。 标准系列应于使用前配制。 取各标准系列 5L 注入高效液相色谱仪，分别采用 3 种流动相进行分析，记录各色谱 峰面积，绘制校准曲线。32 种禁限用染料成分在流动相 1 和流动相 2 中的保留时间参考附 录 B。 5.2.3 样品测定 在设定色谱条件下，取待测溶液 5L 注入高效液相色谱仪，分别采用 3 种流动相体系 - 5 - 进行分析。色谱图检出的物质，经与该物质对照品的保留时间和紫外光谱图比较确证后， 根据峰面积，从校准曲线上查得相应组分的质量浓度。若待测溶液中染料成分的质量浓度 超过了校准曲线线性范围的上限，需对待测溶液进行适当稀释。 注：实际操作过程中，可参考附录 B 中 32 种禁限用染料成分在流动相 1 和流动相 2 中的保留时间， 并结合色谱分离情况和样品中染料成分的不同，对 32 种染料成分进行合理分组，使各染料成分获得完全 分离。 6 平行实验 按以上步骤，做两份样品的平行测定。在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝 对差值不大于这两次测定值的算术平均值的 10%。 7 结果计算 D V w（染料成分）= 100 （1） m 106 式中：w（染料成分） 染发类化妆品中染料成分的质量分数，%； 从校准曲线上查得的待测样液中染料成分的质量浓度，mg/L； V 样品定容体积，mL； m 样品取样量，g； D 稀释倍数（不稀释则取 1） 。 8 回收率和精密度 32 种禁限用染料成分的提取回收率在 82% 115%之间，方法回收率在 86% 114%之间， 相对标准偏差在 1.1% 9.9%之间。 9 色谱图 - 6 - min0510152025 mAU 0 50 100 150 200 DAD1 D, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110808RFJ20110808 2011-08-08 09-06-15RFJ00007.D) 3.808 4.958 5.471 6.213 6.694 7.268 8.391 9.166 10.848 11.149 13.547 14.072 16.359 17.915 21.117 24.136 25.506 图 1 第一组染料混合标准溶液色谱图，流动相 1 1：p-苯二胺；2：p-氨基苯酚；3：甲苯-2,5-二胺硫酸盐；4：m-氨基苯酚；5：o-苯二胺；6：2-氯-p-苯 二胺硫酸盐；7：o-氨基苯酚；8：间苯二酚；9：2-硝基-p-苯二胺；10：甲苯-3,4-二胺；11：4-氨基- 2-羟基甲苯；12：2-甲基雷琐辛；13：6-氨基-m-甲酚；14：苯基甲基吡唑啉酮；15： N,N-二乙基甲 苯-2,5-二胺 HCl；16：4-氨基-3-硝基苯酚 min05101520253035 mAU 0 10 20 30 40 50 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=off (RFJ20110713RFJ20110712 2011-07-13 14-25-18RFJ00026.D) 5.710 7.296 8.745 10.217 11.447 12.618 15.010 22.369 23.385 图 2 第二组染料混合标准溶液色谱图，流动相 2 1：m-苯二胺；2：2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl；3：氢醌；4：4-氨基-m-甲酚；5：2-氨基-3-羟基吡啶； 6：N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐；7：p-甲基氨基苯酚硫酸盐；8：4-硝基-o-苯二胺；9：2,6-二氨 基吡啶；10：N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐 - 7 - min02.557.51012.51517.52022.5 mAU 0 2 4 6 8 10 12 DAD1 E, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110801RFJ20110801 2011-08-01 10-55-31RFJ00021.D) 4.012 5.361 6.454 7.482 8.589 11.781 12.541 22.142 图 3 第三组染料混合标准溶液色谱图，流动相 3 1：N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl；2：苯基甲基吡唑啉酮；3：6-羟基吲哚；4：4-氯雷琐辛； 5：2,7-萘二酚；6：N-苯基-p-苯二胺；7：1,5-萘二酚；8：1-萘酚 - 8 - 附录 A 32 种禁限用染料成分信息表 编号INCI 名中文名称 31,5-Naphthalenediol1,5-萘二酚 51-Naphthol1-萘酚 82,4-Diaminophenoxyethanol HCl2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl 102,6-diaminopyridine2,6-二氨基吡啶 132,7-Naphthalenediol2,7-萘二酚 152-amino-3-hydroxypyridine2-氨基-3-羟基吡啶 212-Chloro-p-phenylenediamine sulfate2-氯-p-苯二胺硫酸盐 242-Methylresorcinol2-甲基雷琐辛 252-Nitro-p-phenylenediamine2-硝基-p-苯二胺 314-Amino-2-hydroxytoluene4-氨基-2-羟基甲苯 324-Amino-3-nitrophenol4-氨基-3-硝基苯酚 334-Amino-m-cresol4-氨基-m-甲酚 344-Chlororesorcinol4-氯雷琐辛 364-Nitro-o-phenylenediamine4-硝基-o-苯二胺 406-Amino-m-cresol6-氨基-m-甲酚 426-Hydroxyindole6-羟基吲哚 61Hydroquinone氢醌 67m-Aminophenolm-氨基苯酚 70m-Phenylenediaminem-苯二胺 72N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-p- phenylenediamine sulfateN,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐 73N,N-Diethyl-p-phenylenediamine sulfateN,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐 74N,N-Diethyltoluene-2,5-diamine HClN,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl 78N-Phenyl-p-phenylenediamineN-苯基-p-苯二胺 81o-Aminophenolo-氨基苯酚 83p-Aminophenolp-氨基苯酚 85Phenyl methyl pyrazolone苯基甲基吡唑啉酮 - 9 - 编号INCI 名中文名称 87p-Methylaminophenol sulfatep-甲基氨基苯酚硫酸盐 88p-Phenylenediaminep-苯二胺 91Resorcinol间苯二酚 95Toluene-2,5-diamine sulfate甲苯-2,5-二胺硫酸盐 96Toluene-3,4-diamine甲苯-3,4-二胺 OPDo-Phenylenediamineo-苯二胺 - 10 - 附录 B 32 种禁限用染料成分在流动相 1 和流动相 2 中的保留时间参考数据表 保留时间/ min 出峰顺序附录 A 中编号物质名称 流动相 1流动相 2 188p-苯二胺5.0496.163 282,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl5.0847.176 370m-苯二胺5.2445.681 483p-氨基苯酚5.5877.133 5152-氨基-3-羟基吡啶6.39611.125 695甲苯-2,5-二胺硫酸盐6.4408.750 772N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐6.72212.067 867m-氨基苯酚6.7877.456 9334-氨基-m-甲酚7.3410.037 1061氢醌7.3388.639 11OPDo-苯二胺7.4098.156 12212-氯-p-苯二胺硫酸盐8.61910.076 1381o-氨基苯酚9.34510.556 1487p-甲基氨基苯酚硫酸盐9.54914.931 15102,6-二氨基吡啶10.72423.23 1691间苯二酚11.16513.336 17252-硝基-p-苯二胺11.52713.290 1896甲苯-3,4-二胺14.24518.765 19314-氨基-2-羟基甲苯14.86320.542 20242-甲基雷琐辛16.58219.765 2173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐16.77534.277 22406-氨基-m-甲酚18.59626.696 23364-硝基-o-苯二胺19.97722.054 2485苯基甲基吡唑啉酮22.17633.794 2574N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl26.43850 - 11 - 出峰顺序附录 A 中编号物质名称 保留时间/ min 流动相 1流动相 2 26324-氨基-3-硝基苯酚26.80734.854 27426-羟基吲哚35.05643.504 28344-氯雷琐辛48.19350 29132,7-萘二酚5050 3078N-苯基-p-苯二胺5050 3131,5-萘二酚5050 3251-萘酚5050 - 12 - 化妆品中 32 种禁限用染料成分的检测方法编制说明 1 任务来源 受国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司委托，根据食药监许函2011126 号 关于委托组织开展化妆品中 m-苯二胺等八种禁用物质或限用物质检测方法标准研究的函 和食药监许函2011262 号关于委托开展化妆品中 24 种染发剂的检测方法研究的函 ，开 展化妆品中 32 种禁限用染料成分检测方法研究，建立染发类化妆品中多种染料成分的快速、 准确、灵敏的色谱检测方法。 2 研究背景 染发作为美容方式之一，已经成为一种世界流行的时尚。在英国，染发剂的消费增长 率已经连续 8 年高居生活必需品之首。染发剂可分为氧化型（永久性）染发剂、直接型 （暂时性或半永久性）染发剂、金属盐类染发剂、天然植物型染发剂等。其中的氧化型染 发剂以其染色效果好、维持时间长等诸多优点在欧洲和美国占到市场分额的 80%。染发剂 中的染料成分多属于芳香胺类化合物，芳香胺中有很多物质具有致癌性，所以染发剂的安 全性一直受到人们的极大关注。在我国，消费人群也不断扩大，由于大面积使用染发剂的 时间并不长，目前染发剂引起的各种健康问题并没有引起人们的足够重视，但是染发人群 出现低龄化，意味着人们染发的时间可能越来越长，而染发剂的各种隐性危害很可能在今 后几年内突出地显现出来。由染发剂引起的过敏反应非常普遍，长期使用还可能致畸、致 突变及引起内分泌效应等。鉴于染发剂存在的各种安全问题及数目庞大的接触者和使用者， 加强对染发剂的卫生管理和日常监督非常必要。 鉴于染发剂存在的各种安全隐患，我国化妆品卫生规范 （2007 年版）规定了 93 种 暂时允许使用的染发剂，并明确了化妆品中最大允许使用浓度和各种限制条件。但是，目 前只能对 8 种染料成分进行检测，覆盖率不到 1%。因此急需建立化妆品中更多染料成分的 检测方法，以满足监督检测的需求。 3 研究现状 针对种类繁多的染料成分，各国科学家一直积极地研究新方法以适应不断增加的新型 染发剂的检测要求。由于氧化型染发剂所占的份额最大，研究人员将重点放在这一领域， - 13 - 只有少数文献报道了直接型染发剂的检测方法研究。文献中报道使用的仪器种类很多，有 薄层色谱（TLC） 、高效液相色谱（HPLC） 、高效液相色谱质谱联用技术（HPLC/MS） 、气 相色谱（GC） 、气相色谱质谱联用技术（GC/MS） 、毛细管电泳（CE）等。在我国， 化妆 品卫生规范 （2007 年版）中列出了 93 种染发剂原料名单，但只推荐了其中 8 种染料成分 的检测方法，存在着大量的检测空白，急需建立相应的方法。根据染料的结构及性质，液 相色谱是比较合适的检测手段。本项目拟采用高效液相色谱法，开展化妆品中 32 种禁限用 染料成分的检测方法研究，建立染发剂中多种染料成分的快速、准确、灵敏的色谱检测方 法，为卫生监管提供良好的技术支持。 4 项目完成情况 根据食药监许函2011126 号关于委托组织开展化妆品中 m-苯二胺等八种禁用物质 或限用物质检测方法标准研究的函和开展化妆品中 m-苯二胺等 8 种禁限用染料成分检 测方法标准研究项目委托协议书的要求，按期完成 8 种禁限用染料成分的检测方法，并 按食药监许函2011262 号关于委托开展化妆品中 24 种染发剂的检测方法研究的函的 要求，同时提交另外 24 种染料成分的检测方法，具体情况如下： （1）建立了化妆品中 32 种禁限用染料成分的高效液相色谱检测方法。本项目中 32 种 禁限用染料成分的方法检出限小于 100g/g，提取回收率在 82%115%之间，方法回收率 在 86%114%之间，相对标准偏差在 1.1% 9.9%之间，在 5mg/L500mg/L 的浓度范围内 线性关系良好（r0.998） ，基本满足分析检测要求。 （2）本方法负责起草单位为中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，参与 验证单位分别是北京市疾病预防控制中心、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防控 制中心和山东省疾病预防控制中心。本方法主要起草人为朱英、朱会卷、杨艳伟，参加起 草人为吴大南、鲁琳、李金花、李蔚、钟志雄、张昀、陈金东、聂鲲。验证结果满足化 妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范相关要求。 5 方法概述 5.1 仪器 Agilent 公司 Agilent1100 高效液相色谱仪。超声波清洗器。离心机。 5.2 试剂 - 14 - 染料标准品：p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸盐、m-氨基苯酚、o-苯二胺、 2-氯-p-苯二胺硫酸盐、o-氨基苯酚、间苯二酚、2-硝基-p-苯二胺、甲苯-3,4-二胺、4-氨基-2- 羟基甲苯、2-甲基雷锁辛、6-氨基-m-甲酚、苯基甲基吡唑啉酮、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl、4-氨基-3-硝基苯酚、6-羟基吲哚、4-氯雷琐辛、2,7-萘二酚、1,5-萘二酚、N-苯基-p-苯 二胺、1-萘酚、m-苯二胺、氢醌、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羟基吡啶、N,N-双(2-羟乙基)-p- 苯二胺硫酸盐、p-甲基氨基苯酚硫酸盐、2,6-二氨基吡啶、4-硝基-o-苯二胺、N,N-二乙基-p- 苯二胺硫酸盐、2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl 共 32 种染料对照品（除 2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl 由化妆品公司提供外，其余 31 种均购于美国 SIGMA 公司和日本东京化成公司，纯度 95%） ；无水乙醇、磷酸、氨水、亚硫酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾为分析 纯，均购于北京化学试剂公司；乙腈和甲醇为色谱纯，购于 Fisher 公司；庚烷磺酸钠为色 谱纯，购于美国 Technologies 公司。 5.3 方法 5.3.1 色谱条件 色谱柱：Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16柱，250 mm 4.6 mm，5m。色谱保护柱： Supelco DISCOVERY RP-AMIDE C16保护柱，20 mm 4.0 mm，5 m。 磷酸盐混合溶液：称取十二水合磷酸氢二钠 1.8g、磷酸二氢钾 2.8g 和庚烷磺酸钠 （C7H15SO3Na）1.0g，用水稀释至 1L，混匀，配制成含庚烷磺酸钠（1g/L）的磷酸盐缓冲液， 加入磷酸溶液（1+9）调节 pH 至 6.0 左右，0.45m 微孔滤膜过滤，作为磷酸盐体系。 流动相 1：乙腈+磷酸盐混合溶液=10+90；流动相 2：甲醇+磷酸盐混合溶液=10+90， 流动相 3：乙腈+磷酸盐混合溶液=40+60。 流量：1.0 mL/min。 检测器：二极管阵列检测器，检测波长为 280 nm。 柱温：25。 5.3.2 标准溶液的配制 染料成分标准储备溶液（染料组分）=10g/L）：称取染料对照品约 100mg（精确至 0.1mg）于 10mL 容量瓶中，以 2g/L 亚硫酸氢钠水溶液 + 无水乙醇 = 1 + 1 的混合溶液定容 至 10mL，配成约 10g/L 的单标溶液。以下几种物质在上述溶剂中的溶解性较差，分别采取 如下措施：甲苯-2,5-二胺硫酸盐和 2-氯-p-苯二胺硫酸盐 2 种物质直接用 2g/L 亚硫酸氢钠水 溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺直接用无水乙醇定容；2-硝基-p-苯二胺和 4-硝基-o-苯二胺 需将称样量减至 25mg，再用无水乙醇定容，配成约 2.5g/L 的单标溶液。储备溶液保存于 - 15 - 4冰箱中，最多使用 2 天。 根据实际情况进行分组后，分别移取染料标准储备溶液于 10mL 容量瓶中，再用无水 乙醇稀释至刻度，配成 500mg/L 的混合标准溶液。各取适量混合标准溶液，用无水乙醇稀 释成 5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L 共 6 个浓度的混合标准系列。 标准系列应于使用前配制。取各标准系列 5 L 注入高效液相色谱仪，记录各色谱峰面积， 绘制校准曲线。 5.3.3 样品预处理 称取样品约 0.5g（精确至 1mg）于 10mL 容量瓶中，用无水乙醇 + 水 = 1 + 1 的混合 溶液定容至 10mL，超声提取 15min。超声过程中，若水温高于 40度应停置降温，冷却后 继续超声，直至样品溶液完全均一化。浑浊溶液可取适量高速离心 5min。上清液经 0.45m 滤膜过滤，滤液作为待测样液备用并尽快测定。若待测样液中染料成分的质量浓度 超过了线性范围的上限，需对待测样液进行适当稀释。 5.3.4 结果计算 根据峰面积，于校准曲线分别得出待测样液中染料成分的质量浓度，样品中的含量应 在此浓度上乘稀释倍数。 6 方法研究 6.1 色谱柱的选择 根据染料成分的结构性质及文献查阅结果，选择流动相 1，并考察了 ODS-2 HYPERSIL C18、ZORBAX SB C8 和 DISCOVERY RP-AMIDE C16 3 种色谱柱，结果分别见图 1、图 2 和图 3。 实验结果表明，使用 ODS-2 HYPERSIL 柱时峰形大多不规则，使用 ZORBAX SB C8 柱时有 部分物质峰形较差，使用 DISCOVERY RP-AMIDE C16柱时多数物质的峰形都能得到较好地改 善。这是因为 DISCOVERY RP-AMIDE C16柱中含有酰胺结构，适宜分离胺类化合物，故选择 DISCOVERY RP-AMIDE C16柱作为分析柱。 - 16 - min01020304050 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=off (D:公 公 公 1ZZDATAZZ0107-1002-0201.D) 2.076 2.430 2.663 2.966 3.043 3.091 3.388 4.186 5.107 5.304 5.824 6.905 7.613 9.298 9.812 11.535 15.023 15.614 16.553 19.647 22.309 22.930 32.924 37.010 图 1 部分染料混合标准溶液的液相色谱图，ODS-2 HYPERSIL 色谱柱 min0510152025 mAU 0 50 100 150 200 DAD1 D, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110909RFJ20110909 2011-09-09 10-07-36RFJ00007.D) 2.721 3.228 3.395 3.721 5.698 5.882 6.997 7.670 8.321 10.335 11.760 13.021 13.865 16.207 19.407 20.794 23.379 24.406 图 2 部分染料混合标准溶液的液相色谱图，ZORBAX SB C8色谱柱 min0102030405060 mAU -20 0 20 40 60 80 100 120 140 DAD1 C, Sig=280,8 Ref=360,100 (D:公 公 公 1ZZDATAZZ70210ZZ000007.D) 4.584 6.618 8.325 23.509 31.820 图 3 部分染料混合标准溶液的液相色谱图，DISCOVERY RP-AMIDE C16色谱柱 6.2 检测波长的选择 根据单标的紫外光谱图，统计了各种染料成分在不同检测波长下特征吸收的分布情况。 - 17 - 实验结果表明，32 种染料类化合物在 220nm 242nm 和 270nm 310nm 均有特征吸收，可 选择 230nm、280nm 为通用检测波长，但 280nm 处的吸收低于 230nm。考虑到 280nm 的 抗干扰能力较 230nm 强，且该波长下的检出限完全能够满足检测要求，故选择 280nm 作 为统一检测波长。 6.3 流动相的选择 6.3.1 水相的选择 根据文献查阅结果，分别试验了乙腈+磷酸盐体系和甲醇+醋酸盐体系。实验结果显示， 磷酸盐体系峰形及分离效果较好，后者分离尚可，峰形稍差，故确定乙腈+磷酸盐体系 =10+90 为流动相体系。 在以上流动相体系的基础上对水相中的对离子试剂浓度及 pH 值进行了进一步优化。 通过在磷酸盐体系中加入 0g/L 1.5g/L 的庚烷磺酸钠及改变 pH 来优化流动相体系。结果发 现，不加庚烷磺酸钠时，峰形稍有拖尾，加入后有较好改善，加入量为 1.0g/L 1.5g/L 时效 果均较好，确定 1.0g/L 为最佳浓度。当流动相 pH 值为 5 时，峰形稍有不规则，pH 值为 6 和 7 时均较好，考虑到该色谱柱最高允许使用 pH 值为 7.5，故最后确定的 pH 值为 6。 6.3.2 有机相的选择 由于染料种类多，单独用乙腈+磷酸盐一套体系难以完全分离，有些物质会重叠出峰， 所以同时选择了洗脱能力不同的另一种有机相甲醇和磷酸盐的混合体系，二者结合进行分 离。32 种染料成分在流动相 1 和流动相 2 中的分离情况见表 1。 表 1 32 种染料成分在流动相 1 和流动相 2 中的保留时间分布情况 保留时间/ min 出峰顺序 附录 A 中编 号 物质名称 流动相 1流动相 2 188p-苯二胺5.0496.163 282,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl5.0847.176 370m-苯二胺5.2445.681 483p-氨基苯酚5.5877.133 5152-氨基-3-羟基吡啶6.39611.125 695甲苯-2,5-二胺硫酸盐6.4408.750 772N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐6.72212.067 867m-氨基苯酚6.7877.456 9334-氨基-m-甲酚7.3410.037 1061氢醌7.3388.639 11OPDo-苯二胺7.4098.156 12212-氯-p-苯二胺硫酸盐8.61910.076 1381o-氨基苯酚9.34510.556 1487p-甲基氨基苯酚硫酸盐9.54914.931 - 18 - 出峰顺序 附录 A 中编 号 物质名称 保留时间/ min 流动相 1流动相 2 15102,6-二氨基吡啶10.72423.23 1691间苯二酚11.16513.336 17252-硝基-p-苯二胺11.52713.290 1896甲苯-3,4-二胺14.24518.765 19314-氨基-2-羟基甲苯14.86320.542 20242-甲基雷琐辛16.58219.765 2173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐16.77534.277 22406-氨基-m-甲酚18.59626.696 23364-硝基-o-苯二胺19.97722.054 2485苯基甲基吡唑啉酮22.17633.794 2574N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl26.43850 26324-氨基-3-硝基苯酚26.80734.854 27426-羟基吲哚35.05643.504 28344-氯雷琐辛48.19350 29132,7-萘二酚5050 3078N-苯基-p-苯二胺5050 3131,5-萘二酚5050 3251-萘酚5050 由以上结果可知，由于乙腈和甲醇的洗脱能力不同，二者结合基本上能分离所有的 32 种染料成分，但是其中的 6-羟基吲哚、4-氯雷琐辛、2,7-萘二酚、1,5-萘二酚、N-苯基-p-苯 二胺和 1-萘酚 6 种成分由于保留时间太长，效率低，不可取。故在此基础上进一步试验了 3 种有机相比例更高的流动相体系以进一步提高上述 6 种成分的洗脱能力，结果见表 2。 表 2 6 种染料化合物在不同流动相体系中保留时间的分布情况 保留时间/min出峰 顺序 物质 名称乙腈+磷酸盐体系=50+50乙腈+磷酸盐体系=40+60乙腈+磷酸盐体=35+65 16-羟基吲哚4.5545.8666.914 24-氯雷琐辛4.8466.4117.922 32,7-萘二酚5.2137.3759.521 41,5-萘二酚6.46410.08114.108 5N-苯基-p-苯二胺6.50510.36014.576 61-萘酚9.73718.52327.991 由表 2 可知，磷酸盐的体积分数降低至 60%65%时，能较好地分离上述 6 种成分， 且体积分数在 65%时其他成分在短时间内出峰完全，不干扰上述 6 种成分的测定。所以当 样品中含有这 6 种成分时可采用此方法以缩短出峰时间。如果继续降低磷酸盐的体积分数， 虽然可以进一步缩短保留时间，但会有部分成分达不到基线分离。苯基甲基吡唑啉酮在流 动相体系 1 中峰宽较大，N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl 有时与 4-氨基-3-硝基苯酚不能完全 分离，故将这 2 种物质也可以加到这 6 种成分中，此时 8 种成分能达到基线分离。 - 19 - 根据以上数据，将 32 种染料类化合物分为三组：第一组使用流动相 1，第二组用流动 相 2，第三组用流动相 3，具体分组情况见表 3、表 4 和表 5，三组的色谱图见图 4、图 5、 图 6。 表 3 第一组所含染料成分 出峰顺序物质名称出峰顺序物质名称 1p-苯二胺92-硝基-p-苯二胺 2p-氨基苯酚10甲苯-3,4-二胺 3甲苯-2,5-二胺硫酸盐114-氨基-2-羟基甲苯 4m-氨基苯酚122-甲基雷琐辛 5o-苯二胺136-氨基-m-甲酚 62-氯-p-苯二胺硫酸盐14苯基甲基吡唑啉酮 7o-氨基苯酚15N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl 8间苯二酚164-氨基-3-硝基苯酚 表 4 第二组所含染料成分 出峰顺序物质名称出峰顺序物质名称 1m-苯二胺6N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐 22,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl7p-甲基氨基苯酚硫酸盐 3氢醌84-硝基-o-苯二胺 44-氨基-m-甲酚92,6-二氨基吡啶 52-氨基-3-羟基吡啶10N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐 表 5 第三组所含染料成分 出峰顺序物质名称出峰顺序物质名称 1N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl52,7-萘二酚 2苯基甲基吡唑啉酮6N-苯基-p-苯二胺 36-羟基吲哚71,5-萘二酚 44-氯雷琐辛81-萘酚 min0510152025 mAU 0 50 100 150 200 DAD1 D, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110808RFJ20110808 2011-08-08 09-06-15RFJ00007.D) 3.808 4.958 5.471 6.213 6.694 7.268 8.391 9.166 10.848 11.149 13.547 14.072 16.359 17.915 21.117 24.136 25.506 图 4 第一组染料混合标准溶液色谱图，流动相 1 1：p-苯二胺；2：p-氨基苯酚；3：甲苯-2,5-二胺硫酸盐；4：m-氨基苯酚；5：o-苯二胺；6：2-氯-p-苯 - 20 - 二胺硫酸盐；7：o-氨基苯酚；8：间苯二酚；9：2-硝基-p-苯二胺；10：甲苯-3,4-二胺；11：4-氨基- 2-羟基甲苯；12：2-甲基雷琐辛；13：6-氨基-m-甲酚；14：苯基甲基吡唑啉酮；15：N,N-二乙基甲 苯-2,5-二胺 HCl；16：4-氨基-3-硝基苯酚 min05101520253035 mAU 0 10 20 30 40 50 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=off (RFJ20110713RFJ20110712 2011-07-13 14-25-18RFJ00026.D) 5.710 7.296 8.745 10.217 11.447 12.618 15.010 22.369 23.385 Area: 124.096 34.325 图 5 第二组染料混合标准溶液色谱图，流动相 2 1：m-苯二胺；2：2,4-二氨基苯氧基乙醇 HCl；3：氢醌；4：4-氨基-m-甲酚；5：2-氨基-3-羟基吡啶； 6：N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐；7：p-甲基氨基苯酚硫酸盐；8：4-硝基-o-苯二胺；9：2,6-二氨 基吡啶；10：N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐 min02.557.51012.51517.52022.5 mAU 0 2 4 6 8 10 12 DAD1 E, Sig=280,8 Ref=off (RFJ20110801RFJ20110801 2011-08-01 10-55-31RFJ00021.D) 4.012 5.361 6.454 7.482 8.589 11.781 12.541 22.142 图 6 第三组染料混合标准溶液色谱图，流动相 3 1：N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCl；2：苯基甲基吡唑啉酮；3：6-羟基吲哚；4：4-氯雷琐辛； 5：2,7-萘二酚；6：N-苯基-p-苯二胺；7：1,5-萘二酚；8：1-萘酚 6.4 线性范围及检出限 结合样品中染料成分的实际加入量和样品称样量，本研究确定最高配制浓度为 500mg/L，最低配制浓度为 5mg/L，这一范围完全满足实验要求。 分别配制 5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L 和 500mg/L 共 5 个系列浓度 - 21 - 的混合标准系列，进行检测分析，记录相应的面积响应值，以被测物质标准溶液的质量浓 度为横坐标（x） ，面积响应值为纵坐标（y）建立标准曲线，进行相关分析得到线性方程和 相关系数（r） 。同时，对含混和标准系列的基质标准溶液进行检测分析，记录相应的面积 响应值，以被测物质基质标准溶液的质量浓度为横坐标（x） ，面积响应值为纵坐标（y）建 立基质标准曲线，进行相关分析得到线性方程和相关系数（r） ，结果见表 6。 表 6 32 种染料成分的标准曲线和基质标准曲线及相关系数 序 号 附录 A 中编号 物质名称标准曲线 相关 系数 基质标准曲线 相关 系数 131,5-萘二酚y= 3.88x - 9.970.9997y= 3.45x + 0.6270.9996 251-萘酚y= 3.86x- 2.561.0000y= 4.00 x - 7.370.9998 382,4-二氨基苯氧基乙醇 HCly = 1.55x - 6.380.9997y = 1.43x - 13.10.9990 4102,6-二氨基吡啶y = 2.00 x + 2.650.9997y = 1.78x + 11.70.9990 5132,7-萘二酚y = 2.93x + 0.9781.0000y= 3.10 x + 0.9610.9999 6152-氨基-3-羟基吡啶y = 7.05x - 2.430.9999y = 6.26x + 40.70.9989 7212-氯-p-苯二胺硫酸盐y = 0.876x - 2.930.9995y = 0.871x + 1.540.9999 8242-甲基雷琐辛y = 1.31x - 3.960.9998y = 1.29x 2.8410-20.9999 9252-硝基-p-苯二胺y = 11.0 x - 41.60.9998y = 11.2x - 20.70.9999 10314-氨基-2-羟基甲苯y = 4.84x - 18.40.9997y = 4.83x - 23.70.9997 11324-氨基-3-硝基苯酚y = 8.86x - 9.380.9999y = 8.97x - 16.80.9999 12334-氨基-m-甲酚y = 3.06x - 1.700.9999y = 3.00 x - 0.1921.0000 13344-氯雷琐辛y= 2.44x - 0.1241.0000y= 2.38x+ 2.681.0000 14364-硝基-o-苯二胺y = 9.22x - 25.20.9999y = 8.90 x + 3.740.9999 15406-氨基-m-甲酚y = 4.63x - 30.70.9994y = 4.21x 24.00.9997 16426-羟基吲哚y=3.98x+6.6410-21.0000y = 3.92x+ 5.151.0000 1761氢醌y = 5.33x + 7.660.9997y = 5.64x + 4.351.0000 1867m-氨基苯酚y = 4.99x - 17.20.9997y = 4.94x - 10.50.9998 1970m-苯二胺y = 3.91x - 30.50.9992y = 3.65x + 0.2321.0000 2072N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐y = 1.76x - 20.70.9990y = 1.77x - 37.10.9982 2173N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐y = 1.26x - 10.50.9989y = 1.13x - 7.870.9990 2274N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺 HCly = 2.22x - 9.680.9999y = 2.05x - 4.470.9997 2378N-苯基-p-苯二胺y= 11.6x- 20.20.9999y = 10.2x + 4.991.0000 2481o-氨基苯酚y = 6.52x - 25.80.9998y = 6.31x - 4.921.0000 2583p-氨基苯酚y = 3.00 x - 12.40.9996y = 2.81x - 8.920.9999 2685苯基甲基吡唑啉酮y= 3.40 x- 19.60.9996y = 2.89x - 10.70.9995 2787P-甲基氨基苯酚硫酸盐y = 1.83x + 3.330.9990y = 1.67x + 10.50.9993 2888P-苯二胺y = 2.79x - 12.70.9995y = 2.69x - 6.920.9998 2991间苯二酚y = 3.58x - 8.580.9998y = 3.34x - 4.420.9999