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印迹技术（blotting）,印迹（blotting）是指将凝胶中的待测核酸等样品用类似于吸墨迹的方法转移到固相膜上，转移之后待测样品在固相膜上的相对位置保持不变。,探针（probe)：广义上讲，探针是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。如：抗原抗体，生物素亲合素，受体配体等。,印迹技术分类,DNAblotting：SouthernblottingRNAblotting：NorthernblottingWesternblotting：immunoblotting,一、定义,Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。是一种检测蛋白质表达水平的方法。,二、原理,WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,WesternBlot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,WesternBlot一般流程,蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,三、过程,1、提取蛋白质,RIPA裂解液,Tris.cl(pH7.5)50mMNacl150mMNP-401%脱氧胆酸钠0.5%SDS0.1%EDTA1mMPMSF1mMNa3VO41mM,现用现加,（提取总蛋白，主要是胞浆蛋白的裂解液）,其中的NaCl和Trisbase是构成提取液的主要成分，起到缓冲液的作用，缓冲液可以对抗蛋白质溶液PH值的改变，因此对于保持蛋白质的稳定以及保证实验重复性十分重要。EDTA为金属离子鳌合剂，由于细胞内许多酶的活性需要金属离子的存在，因此加入鳌合剂后可以抑制蛋白酶的活性，也就可以防止蛋白被分解。而脱氧胆酸钠和SDS都是属于阴离子型去垢剂。使用这些去垢剂的作用是可以将蛋白质以单体的形式分离。NP-40属于非离子型去垢剂，与离子型去垢剂相比，其对蛋白之间的相互作用干扰较弱，但是对于分离功能性的蛋白复合物较为适用。PMSF：苯甲基磺酰氟，Na3VO4是Na-K+ATP酶的抑制剂两者都是蛋白酶抑制剂。,2、蛋白定量：测定溶液中蛋白质浓度。,（1）凯氏定氮（2）测定OD280：可测定芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）的含量，但易受组成和杂质的影响。（3）考马斯亮蓝G250染色：侧链集团与G250显色，根据深浅测定蛋白质含量。（4）福林酚试剂法（Lowry),蛋白质的酪氨酸、色氨酸半胱氨酸的残基Cu2+,OH,紫色化合物,紫色化合物还原磷钼酸、磷钨酸,蓝色化合物,比色测定,分光光度计,原理：在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反应BiuretReaction）蛋白质-铜复合物使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应）,常用改良的Lowry法：,123456sample1sample2sample3,12481632101010(l),BSA(1mg/ml),999998996992984968990990990(l),NS,浓度（g/l),12481632,+A液0.9ml,50，10min,+B液0.1ml,室温，10min,+C液3ml,50，10min,平衡到室温，650nm测吸光度值,（2g酒石酸钾钠100gNacl溶于500ml1MNaOH中，再定容至1000ml）,（2g酒石酸钾钠1g5H2O.CuSO4，先溶于少量水中，再定容至90ml，再加入10ml1MNaOH）,（市售的酚试剂，1:15稀释）,改良的Lowry法：,根据标准品绘制标准曲线,3、SDSPAGE,不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS（与蛋白结合，使蛋白变性，亚基分开，并使蛋白质带上相同的电荷，这样蛋白在电场中的泳动速度只与其单个亚基的分子大小有关，与其空间构象和本身带电多少无关）,SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。,浓缩原理：,浓缩胶中Arc的浓度是5，形成的孔径大，蛋白泳动快分离胶中Arc的浓度是8，形成的孔径小，蛋白泳动慢,蛋白质拥挤在交界面处,Tris甘氨酸系统,浓缩胶pH=6.8，泳动速度为Cl蛋白质甘氨酸,分离胶pH=8.8，甘氨酸不再影响蛋白泳动,样品进入分离胶前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pKa的pH值时，任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用pH6.7的TrisHCI缓冲液，电极液用Tris一甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，其有效泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，并加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子,建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。,蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶中的TrisHCI的浓度，而与样品中蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。,+,5电泳缓冲液,Gly23.5gTris3.375g,250mlH2O,使用时：76ml5bf+4ml10%SDS400ml,5loadingbf,0.5MTris.clpH6.85mlSDS1g-巯基乙醇0.6ml50%甘油8ml0.25%溴酚蓝1mlH2O44ml,使用时与蛋白样品混合，稀释成1，100煮沸5min,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单丙）和甲叉双丙烯酰胺（双丙）聚合而成聚合过程需要催化剂。,分离胶8,30Arc2.16ml0.67ml(29g单丙1g双丙100ml)1MTris.clpH=8.83ml0.5ml(pH6.8)10%SDS80ul40ul10%AP80ul40ulTEMED5ul4ulH2O2.67ml2.7ml8ml4ml,浓缩胶5,催化剂,120v1-2h,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidgelelectrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N，N_甲叉双丙烯酰胺N，N一Methylenebisacrylamide，Bis)，在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的。化学聚合的引发剂是过硫酸铵（Ap）在形成中提供自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。催化剂是四甲基乙二胺（Tetramethylethylenediamine,TEMED）则可加快引发剂释放自由基的速度，具体反应是过硫酸铵在水溶液中形成一个过硫酸自由基，此自由基可以激活TEMED，TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转换化成丙烯酰胺自由基经反应多聚物聚合成网状结构的凝胶状，其网状孔径大小由聚合条件及单体浓度决定。S2O82-2SO4-,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=ONHCH2NHC=OCH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=OC=ONHNH2,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,8.3,8.3,8.9,6.7,凝胶浓度与蛋白分离范围,4、转膜,电转移，PVDF膜,10转膜缓冲液,Gly14.5gTris29gSDS1.85g,500ml,使用时：100ml10转膜bf用水稀释成800ml，再加200ml甲醇（浓度为20，起固定蛋白的作用，边转膜边固定）,90V，23h（90kDa)，根据所测蛋白的分子量决定。,膜的选择：NC：蛋白结合量80100g/cm2，机械强度小，脆性大尼龙：蛋白结合量200g/cm2，机械强度高，单易被染料染色。PVDF（聚乙烯二氟）：综合以上优点，但需要激活预处理。,转膜方法,半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。,Western装置,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,Dalton,SDSPAGE,转膜后检测,丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,5、封闭,脱脂奶粉（5）BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）,封闭液,5脱脂奶粉1BSA,方法,室温振荡45h372h4过夜,6、一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37一小时，4过夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。,可用封闭液或TTBS稀释一抗到合适的浓度例如：检测大鼠actin蛋白，使用兔抗大鼠的actin抗体（1：1000）TTBS5ml+5ul抗体,室温振荡45h372h4过夜,方法,没有注明可以用来做westernblot的一抗，可以用来做westernblot吗？不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于westernblotting，因为在westernblotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。,7、显色,4氯1萘酚显色,TBS8ml4氯1萘酚1.6ml(甲醇配制的3mg/ml溶液）30%H2O24ul,避光显色510min,发光显影,发光试剂A和B，等体积混合后，可与辣根过氧化物酶反应，发出绿色荧光，使X光片显影。,DAB显色,二氨基联苯胺与辣根过氧化物酶反应，生成有色产物。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP),1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting过程,ImmunoBlotting,Blotting,待测蛋白,硝酸纤维素膜,一抗,二抗,辣根过氧化物酶,底物,产物，并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧