Westernblot原理和技术上课.ppt

为什么要作蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。,定义：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,Towbin,H.,etal.(1979).Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,4350-4354.,WesternBlot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,基本流程,提取细胞或组织蛋白、测定大致含量制备SDS-PAGE胶蛋白样品变性、电泳电泳转膜封闭一抗TBST洗涤HRP标记的二抗TBST洗涤ECL试剂作用X-光片曝光、显影结果分析,BCA法蛋白浓度定量基本原理,BCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠，bicinchoninicacid)在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+（biuretreaction）。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。,不连续的电泳缓冲体系。SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺SDS（十二烷基磺酸钠）配胶的Tris缓冲液TEMED（四甲基乙二胺，加速剂）APS（过硫酸铵，催化剂）Tris-甘氨酸电泳缓冲液,SDS：,阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。,凝胶浓度与蛋白分离范围,SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方表：,灌制分离胶隔绝空气,灌制积层胶插入梳子,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g。,不连续电泳：,电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统。,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍：,湿转系统,半干转移系统,丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗PVDF膜，换水2次。考马斯亮蓝染色（染胶）,转膜后检测（此步可以省略）,封闭,为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,WesternBlotting方法一:直接法,优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,WesternBlotting方法二:间接法,优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.可选择不同的Marker缺点：1.交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化,间接WesternBlotting操作流程:,一抗、二抗孵育,把PVDF膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）,不可不加-内参的选择,原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin用法：二抗孵育时加入HRP标记内参抗体分子量相差不大分子量大小相差比较明显,WesternBlot注意事项及常见问题,SDS-PAGE,1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2(载荷面即：如果你的胶槽是5mm1mm，则载荷面为：1mm5mm=5mm2)。3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。,SDS-PAGE,5）电泳中常出现的一些现象：条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。,TRANSFER,1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸=膜=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。,TRANSFER,4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为1.5小时，(1mA-2mA/cm2，10%gel)，