农业微生物学河南农业大学

Goodafternoon,第四章微生物的营养和培养基MicrobialNutritionandMedium,第一节微生物的6类营养要素第二节微生物的营养类型第三节营养物质进入细胞的方式第四节培养基,第一节微生物的6类营养要素,1概念2功能3细胞化学组成4营养物质,一、概念,营养物(nutrient)：具有营养功能的物质。指能够为微生物的正常生命活动提供结构物质、能量、代谢调节的物质和必要的生理环境。营养（nutrition)：生物体从外部环境中摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一切最基本的生理功能。,二、微生物营养的功能,参与微生物细胞的组成提供微生物机体进行各种生理活动所需的能量形成微生物代谢产物的来源营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础，失去这个基础，生命也就停止。,三、微生物细胞的化学组成,组成元素大量元素macroelements：碳、氢、氧、氮、磷、硫其他元素traceelement：钾、钠、钙、镁、铁、锰、铜、钴、锌、钼等存在方式有机物：蛋白质、糖、脂、核酸、维生素，降解产物、代谢中间产物无机盐灰分：1)参与有机物组成；2)单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在.水细胞干重的70%90%，以游离水和结合水两种形式存在。其中结合水占水总量的17%28%,四、微生物细胞的营养物质,1.碳源（Carbonsource）2.氮源（Nitrogensource)3.能源（Energysource)4.生长因子（Growthfactor)5.无机盐6.水,1、微生物的碳源Carbonsource,定义：一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物。碳占细胞干重的50。功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。碳源谱:无机碳：如CO2和碳酸盐等。有机碳：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、麸皮、米糠等；饴糖；单糖）,脂类、醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含氮的化合物。异养微生物：必须利用有机碳源的为数众多的微生物。自养微生物：以无机碳源做为主要碳源的种类极少的微生物。,微生物可利用的碳源,糖类：葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纤维二糖，纤维素，半纤维素，甲壳素，木质素等有机酸：乳酸，柠檬酸，延胡索酸，低级脂肪酸，高级脂肪酸，氨基酸等醇类：乙醇脂类：脂肪，磷脂烃类：天然气，石油，石油馏分，石蜡油CO2：CO2碳酸盐：NaHCO3,CaCO3,白垩，等其他：芳香族化合物，氰化物，蛋白质，肽，核酸等,微生物工业发酵中用做碳源的原料,传统种类：糖类（单糖，饴糖）淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等）麸皮各种米糠等代粮发酵：纤维素、石油、CO2,2、微生物的氮源Nitrogensource,概念：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源。氮占细菌干重的1215。功能：1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸，以及含氮代谢物等的原料；2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。种类：无机氮源：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、大气N2等有机氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、鱼粉、黄豆饼、花生饼等,蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。生理酸性、碱性、中性盐,3、微生物的能源,化能异养微生物：有机物（同碳源）化学物质化能自养微生物：还原态无机NH4+,NO2-,S,H2S,H2,Fe2+等物能源谱（不同碳源）光能：光能自养和光能异养微生物,4、生长因子（growthfactor）：,定义:是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。狭义：维生素广义：维生素、氨基酸、碱基、嘌呤、碱基、生物素等,1.purinesandpyrimidines:requiredforsynthesisofnucleicacids(DNAandRNA)2.aminoacids:requiredforthesynthesisofproteins3.vitamins:neededascoenzymesandfunctionalgroupsofcertainenzymes,categories:Growthfactorsareorganizedintothreecategories:,缺乏合成生长因子能力的微生物称为“营养缺陷型”微生物。有些微生物缺乏或丧失合成某种或某些氨基酸的酶，所以不能合成生长所必需的氨基酸，这类微生物被称为“氨基酸缺陷型”。例如：肠膜明串珠菌（leuconostocmesenteroides）常常需要由外源供给多种氨基酸才能生长,根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：,1.野生型(wildtype)原养型不需要生长因子而能在基础培养基上生长的菌株2.营养缺陷型(auxotroph)由于自发或诱发突变等原因从野生型菌株产生的需要提供特定生长素物质才能生长的菌株,5、微生物的无机盐,定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式共给。大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe（微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co（微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）,生理功能,无机元素的来源和功能,6、水,水的功能：是微生物细胞的重要组成部分，使原生质保持溶胶状态，保证代谢正常进行起到物质溶剂和运输介质的作用有效控制细胞内的温度变化,水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水.不同细胞及不同细胞结构中游离水的含量有较大差别：,微生物对水的需要程度（水对微生物生长的影响）常用环境（或基质）中的水活度值（wateractivity,w）表示。定义：所谓w就是水的有效浓度，在一定的温度条件下，溶液的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比即：w=/o表示溶液的蒸汽压o表示纯水的蒸汽压在w为0.600.99的环境条件均有微生物生长，但对某种微生物而言，它对w的要求是一定的，微生物对水的需求有相当的变化程度。即微生物不同，其生长的最适w亦不同。,几类微生物生长最适w,为了表示微生物生长与水的关系，有时也常用相对湿度（RH)的概念（w100=RH）；通常也用测定蒸气相中相对湿度的方法得知溶液或物质的水活度。,第二节微生物的营养类型,根据生长所需要的碳源性质分：异养型：在生长时需要以复杂的有机物质作为营养物质自养型：在生长时能以简单的无机物质作为营养物质根据生长时能量的来源分：化能营养型：依靠化合物氧化释放的能量进行生长光能营养型：依靠光能进行生长按供氢体分无机营养型生物有机营养型生物按碳源、能源和供氢体的不同分为：,营养类型,1。光能自养型微生物以C02作为唯一碳源或主要碳源，并利用光能，以无机物如硫化氢作为供氢体将CO2还原成细胞物质。光能CO2H2SCH2O+2S+H2O光合色素光能自养型微生物包括蓝细菌（含叶绿素）、红硫细菌和绿硫细菌等少数微生物（含细菌叶绿素），由于含有光合色素，因而能使先能转变成化学能（ATP），供机体直接利用。,2。光能异养型微生物利用光能，以简单有机物（醇、有机酸）为供氢体同化CO2。红螺菌属中的一些细菌属于此种营养类型。光能2(H3C)2CHOH+CO22CH3COCH3+CH2O+H2O光合色素光能异养型细菌在生长时大多数采要外源的生长因子,化能自养型微生物以CO2作为唯一或主要碳源，以无机物氧化释放的化学能为能源,，利用无机物做为供氢体，使CO2还原成细胞物质。这类微生物主要有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌。它们在自然界物质转换过程中起着重要的作用。,化能异养型微生物多数微生物属于化能异养型，其生长所需要能量和碳源通常来自同一种有机物。根据化能异养型微生物利用有机物的特性，又可以将其分为下列两种类型：腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。寄生型微生物：寄生在生活的细胞内，从寄生体内获得生长所需要的营养物质。,Majornutritionaltypesofmicroorganisms,第三节营养物质进入细胞的方式,1单纯扩散(simplediffusionorpassivediffusion),2促进扩散(facilitateddiffusion/transport),3主动运输(Activetransport),4基团转位(Grouptranslocation),1、单纯扩散(simplediffusionorpassivediffusion),被输送的物质，靠细胞内外浓度差为推动力，以扩散的形式从高浓度区向低浓度区,特点：1.非特异性；2.不需要载体；3.不需消耗能量；4.顺逆浓度梯度进行；5.速度很慢6.可运送的养料有限(水或溶于水的气体（氧）及小极性分子，如尿素、甘油、乙醇等）,特点：可运送的养料有限：限于水、溶于水的气体，及分子量小，脂溶性、极性小的营养物质。是非特异性的营养物质吸收方式：如营养物质通过细胞膜中的含水小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内扩散；在扩散过程中营养物质的结构不发生变化：即既不与膜上的分子发生反应，本身的分子结构也不发生变化；物质运输的速率较慢：速率与胞内外营养物质的浓度差有关，即随细胞膜内外该物质浓度差的降低而减小，直到胞内外物质浓度相同；不需要载体参与；不需要代谢能：因此，物质不能进行逆浓度运输。,smosis,flowstowardshighsaltconcentrations,单纯扩散模式图,三营养物通过与细胞膜上载体蛋白carrierprotein（也称作透过酶permease）的可逆性结合来加快其传递速度,促进扩散(facilitateddiffusion/transport),特点：在促进扩散过程中营养物质本身在分子结构上也不会发生变化不消耗代谢能量，故不能进行逆浓度运输运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定需要细胞膜上的载体蛋白（透过酶）参与物质运输被运输的物质与载体蛋白有高度的特异性养料浓度过高时,与载体蛋白出现饱和效应促进扩散的运输方式多见于真核微生物中，例如通常在厌氧生活的酵母菌中，某些物质的吸收和代谢产物的分泌是通过这种方式完成的。,Proteinsthatactascarriersaretoolargetomoveacrossthemembrane.Theyaretransmembraneproteins.Theycyclebetweentwoconformationsinwhichasolutebindingsiteisaccessibleononesideofthemembraneortheother.,oractiveansport,主动运输(Activetransport),需要消耗能量，通过膜上的载体蛋白逆浓度梯度吸收营养物质的过程。,特点：物质在主动运输的过程中消耗能量能逆浓度梯度吸收具有被运输的物质和载体蛋白对应的专一性被运输的物质在转移的过程中不发生任何化学变化主动运输的能量来源有两种方式：一种是质子动力（过程中所需的能量的来源不同，好氧微生物中直接来自呼吸能，厌氧微生物主要来自化学能，光合微生物中则主要来自光能。主动运输是微生物吸收营养物质的主要方式。,Comparisonofpassiveandactivetransport.,Legend:Ifunchargedsolutesaresmallenough,theycanmovedowntheirconcentrationgradientsdirectlyacrossthelipidbilayeritselfbysimplediffusion.Examplesofsuchsolutesareethanol,carbondioxide,andoxygen.Mostsolutes,however,cancrossthemembraneonlyifthereisamembranetransportprotein(acarrierproteinorachannelprotein)totransferthem.Asindicated,passivetransport,inthesamedirectionasaconcentrationgradient,occursspontaneously,whereastransportagainstaconcentrationgradient(activetransport)requiresaninputofenergy.Onlycarrierproteinscancarryoutactivetransport,butbothcarrierproteinsandchannelproteinscancarryoutpassivetransport.,主动运输模式图,细胞膜,细胞膜外,细胞膜内,恢复原构象,移位,再循环,结合,构象改变,Na+-K+-ATP酶系统,Na+-K+-ATPase是存在于原生质膜上的一种重要离子通道蛋白功能:利用ATP能量将Na+由细胞内“泵”出胞外,并将K+“泵”入胞内。该酶由大小两个亚基组成（MW:12万,5.5万）,作用步骤:1.ATP酶(E)在细胞内侧与3个Na+结合,同时消耗能量;2.磷酸化ATP酶(E+)构象变化将Na+排除胞外,并与2个K+结合;3.K+激发E+脱磷酸化恢复为E,同时将K+运入细胞.,基因转位是一种特殊的主动运输，与普通的主动运输相比，营养物质在运输的过程中发生了化学变化（糖在运输的过程中发生了磷酸化）。其余特点与主动运输相同。基因转位主要存在于厌氧和兼性厌氧型细菌中，也主要是用于单（或双）糖与糖的衍生物，以及核苷与脂肪散的运输,基团转位(Grouptranslocation),在酶的作用下HPr被激活,在酶的作用下P-HPr将磷酸转移给糖,运送机制:是依靠磷酸转移酶系统,即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统.运送步骤:1.热稳载体蛋白(HPr)的激活细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。酶1PEP+HPr丙酮酸+P-HPrHPr是一种低分子量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。,2、糖被磷酸化后运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的酶2结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶2的作用将糖-磷酸释放到细胞内。酶2P-HPr+糖糖-P+HPr酶2是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶2。,四种运输营养物质方式的比较,第四节培养基(medium),定义：根据微生物的营养要求，由人工配制的、微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质。特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且应比例适当。一旦配成必须立即灭菌。用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品等。,一、培养基的配制原则,1。目的明确：培养基组分应适合微生物的营养特点2。营养协调：营养物的浓度与比例应恰当3。条件适宜：物理化学条件适宜4。经济节约：根据培养目的选择原料及其来源,（一）培养基组分应适合微生物的营养特点,按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基LB(Luria-Bertani)放线菌：高氏一号培养基真菌：察氏合成培养基PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌；麦芽汁,（二）营养物的浓度与比例应恰当,浓度过高微生物的生长起抑制作用，浓度过小不能满足微生物生长的需要。碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标；,碳源中的碳原子的mol数氮源中所含的氮原子的mol数,C/N比值=,例：谷氨酸生产中C/N4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N3/1时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。,（三）物理化学条件适宜,（1）pH:各类微生物的最适生长pH值各不相同：在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐（CaCO3）；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液,（2）渗透压等渗溶液适宜微生物生长高渗溶液细胞发生质壁分离低渗溶液细胞吸水膨胀,大多数微生物适合在等渗的环境下生长，而有的菌如Staphylococcusaureus则能在3mol/LNaCl的高渗溶液中生长。能在高盐环境（2.86.2/LNaCl）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。,（3）氧化还原电势(redoxpoyential)各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求：好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0.1V以上的环境中均能生长).厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵培养基是多氧化还原型的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表其综合结果。对微生物影响最大的是：分子氧的浓度培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。,（四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源,该培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？,提倡以粗代精，以野代家，以废代好，以简代繁，以烃代粮，以纤代糖，以氮代朊，以国代进。,高压蒸气灭菌一般培养基:1.05Kg/cm2,121.5,15-30min含糖培养基:0.56Kg/cm2,112.6,15-30min过滤除菌,分别灭菌,间歇灭菌的应用,附：培养基的灭菌,附图：过滤灭菌,附：器皿的灭菌及无菌室的消毒,器皿的灭菌：干热空气：160，2小时无菌室的消毒：紫外光化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）,二、培养基的类型及其应用,-1根据所培养微生物的微生物类群来分细菌培养基放线菌培养基霉菌培养基-2根据培养目的来分种子培养基(seedculturemedium)发酵培养基(fermentationmedium),-1,细菌培养基营养肉汤（nutrientbroth)：牛肉膏3g；水1000ml；蛋白胨5g；pH7.27.4放线菌培养基高氏1号：可溶性淀粉20g；KNO31g;K2HPO41gMgSO40.5gNaCl1g;FeSO47H2O0.5g水1000ml;pH7.27.4霉菌培养基查氏（zapek)培养基：蔗糖30g;KCl0.5g;MgSO4.H2O0.5g;FeSO40.5g水1000ml;K2HPO41g;NaNO33g;pH6.7酵母菌培养基麦芽汁培养基,-3按对培养基成分的了解程度来分天然培养基(complexmedium)：也称作chemicallyundefinedmedium。利用化学成分还不完全清楚或不恒定的天然物质，（如动植物、微生物体及其提取物等）制成的培养基，如细菌培养基、麦芽汁培养基等。天然培养基比较经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。缺点是成分不清。合成培养基(syntheticmedium)：也称作chemicallydefinedmedium.由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一般适于在实验室范围内他有关研生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等.半合成培养基(semi-definedmedium)：在合成培养基的基础上添加些