动物体内转染(Entranster)答疑

动物体内转染答疑-用RNA或DNA直接注射动物完成干扰和表达动物体内转染，简单地说，就是用RNA和DNA直接打动物完成干扰和表达。再通俗地说，用合成的(RNA)或者提取的核酸(DNA)，就可以完成以前的动物转基因或者基因敲除的实验，无需再用病毒或者基因敲除动物。实验周期可以缩短为几天，花费几千元即可进行实验。 动物体内转染技术的出现，让广大生物医学研究者，轻松进行动物的基因干扰、导入等操作。尤其是临床医学工作者，可以在很少工作量较少经费的情况下，直接针对研究的疾病进行动物实验，发表高水平文章。比如在英格恩客户已发表的文章中，有尾静脉注射DNA研究治疗病毒性心肌炎，有皮下肿瘤注射miRNA研究治疗结肠癌，有脑室注射siRNA研究脑缺血机理，有皮肤涂抹siRNA治疗皮肤瘢痕等。这些研究都非常有临床和现实意义。 由于动物体内转染技术应用的时间不长，对这种崭新的技术人们还不太了解。此次受丁香园邀请，特开此动物体内转染相关实验技术答疑专帖。对站友们提出的问题给予解答，希望能够和大家相互学习，共同进步。任何与动物体内转染有关的问题（包括实验设计、产品、实验过程、结果分析、文献等问题），大家尽管提出，我们会尽力解答，也欢迎站友们参加讨论。 技术资料目录：1.体内转染试剂的原理和方法 1).动物体内转染技术可以做什么？ 2).体内转染的原理 3).体内转染的过程 4).体内转染需要的实验条件 5).体内转染适合进行怎样的实验 6).体内转染可以在哪些组织器官进行 7).应用体内转染试剂发表的部分文献 8).动物体内转染和病毒感染的比较 9).动物体内转染和基因敲除的比较2.体内转染实验的设计 1).需要的材料 2).需要的时间 3).需要的费用 4).常见的结果检测方法3.体内转染过程相关问题及解答 1).体内转染试剂对动物有什么影响？ 2).注射后，试剂是如何在体内分布的，有靶向性吗？ 3).转染试剂和核酸需要使用多少？提问与解答：1、如何技术上解决（排除）RNAi的非特异性？是否需要复原实验（Rescue Experiment）。2、实验的重复性/可靠性如何？需要使用多少只动物，才能实现90-95%可信度？3、遗传性状改变后能维持多久？如果性状的改变是暂时的，那么经过一段时间后，动物能否恢复到原有的生理状态（没有后遗症）？4、 这种siRNA的体内注射，在不同的组织中可能转染效率差别很大， 楼主能否告知哪些组织的转染效率高，哪些低？5、不同的组织和注射方法，如何评估干扰效率？6、目前有没有携带荧光的siRNA可以用于相关实验？7、我目前正在用病毒感染的方法，效果不是太好，病毒感染和体内转染有什么不一样？病毒感染做不好，体内转染能做好吗?8、不是太懂，动物体内转染技术用来干什么，主要的特点和优点是什么？9、很感兴趣，你们的动物体内转染试剂有文献支持吗？10、再问一下，你们试剂的原理是什么，使用方法麻烦吗？11、请问体内转染可以转染肺组织么？12、是直接通过气管内注射？13、转染的基因过表达能够维持多长时间？14、可以直接用于关节内软骨相关基因转染么，如何转染？直接关节腔注射还是尾静脉注射？15、我想请问一下你们这个转染试剂多少钱？我想直接瘤内注射是否可以？16、太好了，找到专家了！请教几个问题，体内转染用慢病毒效果好吗？目的组织是心肌，是尾静脉注射好呢还是心肌局部注射好？17、可以腹膜腔注射么？18、每个目的器官用量怎么安排？每次还用同位素检测转染效率，那也不便宜啊。19、如果我做大鼠睾丸的RNA干扰，您能否建议是尾静脉注射，还是涂抹还是其他方法呢？20、这个实验技术很新呢，眼前一亮，我的实验是移植一种细胞到视网膜下腔，想要干扰这种细胞中的某个基因的表达，如果通过常规的体外RNAi技术比较麻烦，想直接在移植细胞的时候同时用你们的这个进行局部体内注射，这样是否可以实现呢？21、第二个问题是，我的实验中是要干扰移植细胞中的神经营养因子的表达，但是神经营养因子种类很多，包括bFGF、BDNF、NT-3、NT-4/5等，如果想抑制多种神经营养因子的表达有可能吗？谢谢！22、你好，请问想要消除小鼠脑内海马神经元细胞中某种microRNA的表达，可以用你们的转染试剂么？怎么注射，侧脑室注射还是尾静脉注射比较好？另外，你们试剂的价格是多少？问与答：1、如何技术上解决（排除）RNAi的非特异性？是否需要复原实验（Rescue Experiment）。RNAi的非特异性是每个RNAi实验所必须考虑的，一般通过设计多条针对同一个基因的siRNA等，如果都能得到同样的结果，一般认为是特异性的。如果您不能确定是否有非特异性，理论上是需要Rescue Experiment的。但这些实验一般都在细胞实验阶段。在动物实验阶段，可通过合适的对照来排除非特异性。2、实验的重复性/可靠性如何？需要使用多少只动物，才能实现90-95%可信度？实验的重复性或可靠性和整体的实验分不开，如果基础实验（比如细胞实验）充分，而且又有其他的方法进行印证，那么实验的可靠性就很高，这时动物体内转染就不需要太多动物，几十只动物，能说明问题就可以。但如果其他的实验较少，单纯用一种方法进行实验，就需要排除实验过程的客观因素的影响，比如动物本身的差异，比如实验过程的差异，比如检测方法的误差等。这时就需要动物数量足够，以达到统计学上的误差要求。3、遗传性状改变后能维持多久？如果性状的改变是暂时的，那么经过一段时间后，动物能否恢复到原有的生理状态（没有后遗症）？属于瞬时的转染，对目标基因的改变，一般注射1次，可以维持7-14天左右。随后，随着转入的核酸的代谢，效应减弱消失。动物是否回复到原有的生理状态，这与目标基因有关系。如果希望长期维持动物的转染状态，可以多次注射。 4、这种siRNA的体内注射，在不同的组织中可能转染效率差别很大， 楼主能否告知哪些组织的转染效率高，哪些低？如果通过尾静脉注射，确实不同组织的分布有差异。一般来说，肝、肺、肾的分布最高。一般分布高的地方转染效率也相对较高。但不是其他的组织器官效果就不好，相反，对绝大多数的器官组织来说，采用体内转染技术，效果也很好。比如一般认为神经细胞难以转染，而且尾静脉动物给药，通过血脑屏障到达大脑也不容易。但实验表明，用体内转染技术进行尾静脉转染，能明显转染大脑神经细胞。还有通常认为难以转染的心肌细胞、血管内皮细胞和原代细胞，用体内转染技术也有这样的效果。所以，采用体内转染技术后，很多难以想象的组织器官等都可以应用，比如，甚至可以皮肤涂抹siRNA转染到瘢痕组织，影响毛发生长。5、不同的组织和注射方法，如何评估干扰效率？针对具体的组织器官，不同的注射方法会明显影响效果。比如，大脑神经细胞的体内转染，可以采用尾静脉注射和侧脑室注射，用侧脑室的方法就好得多。再比如，肺部的体内转染，用气管灌注就比用尾静脉注射的方法好得多。体内转染试剂和核酸的混合物与靶器官的接触越直接越充分，效果越好。干扰效率可以理解为干扰的细胞数量和全部细胞的数量的比例。在体外细胞实验中，这2个数字可以精确计算。但在动物体内无法精确统计。一般评估效果，我们建议在分子水平，用RT-PCR，在细胞水平，用Western-Blot，在组织水平，用病理生理等方法。6、目前有没有携带荧光的siRNA可以用于相关实验？目前携带荧光的siRNA，如FAM荧光基团标记的，荧光比GFP等弱很多，而且光点很小，穿透性很差。如果需要评估siRNA在动物体内的分布，我们建议还是用灵敏度和穿透性更好的同位素标记。7、我目前正在用病毒感染的方法，效果不是太好，病毒感染和体内转染有什么不一样？病毒感染做不好，体内转染能做好吗? 1）关于病毒感染和体内转染的区别: 动物转染试剂病毒感染实验周期最快3天就可以出结果需要进行克隆、病毒包装等一系列实验，周期短则1个月，长则达数月。灵活性更换核酸简单，利于筛选。更换核酸序列，需要重新构建和包装病毒，复杂而且费工费时。效 果方法简单，实验环节少，尤其在转染小片断RNA方面，如：siRNA, miRNA, mimic, inhibitor等，有非常明确的效果，而且普通的用于细胞实验的RNA就可以，效果非常肯定。理论上效果不错，但由于病毒实验环节较多，任何一个环节出问题都容易导致实验失败，而且失败后，不易查找原因。实际上很多实验室失败后，往往暂停或终止了动物实验，导致课题研究质量的降低。持续时间属于瞬时转染，单次转染效果持续7-14天，但可以通过多次注射维持转染效果可以通过整合到基因组内长期发挥作用费用只花费几千元即可立即进行小规模预实验来确定动物实验效果。进行预实验也需要花费数万元和数月包装病毒，环节多，易出错，不易成功。2）关于病毒感染如果效果不好，体内转染是否可以病毒感染和体内转染属2种实验手段，单从方法看，病毒感染和体内转染不相关，所以病毒感染如果不好，体内转染并不受影响，反之，也一样。当然如果实验本质上就不会有效果，比如错误的干扰序列，那么采用任何方法都不会成功。 一般来说，如果细胞实验是成功的，基本可以排除实验的不可行性，那么就主要是方法有问题，这时，如果病毒感染不好，可以采用体内转染。 另外，现在英格恩有病毒感染体内增强试剂，可以大大提高病毒的感染效果。您也可以试一下这个。8、不是太懂，动物体内转染技术用来干什么，主要的特点和优点是什么？1）简单地说，如果你希望影响动物某部位基因的功能，增强、减弱，以及引入外源基因。就可以用动物体内转染技术。 2）主要特点优点：比较以前的病毒感染、基因敲除、转基因动物等方法，要简单得多，用合成的小RNA与体内转染试剂混合注射动物，就可以进行类似基因敲除的实验。同样，用质粒DNA与体内转染试剂混合注射动物就可以进行类似转基因动物的实验。 非常方便，注射几天后就可以观察结果，而且可以随时更换核酸，完成更多基因，更深入的实验。 而且，省时间和经费。病毒感染需要动辄上万的经费和数月包装病毒的时间。基因敲除老鼠和转基因动物也很麻烦。9、很感兴趣， 你们的动物体内转染试剂有文献支持吗？这是部分的文献，附件有部分全文。1.CNS Neurosci Ther. 2013 May 3.The Involvement of Programmed Cell Death 5 (PDCD5) in the Regulation of Apoptosis in Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury.(脑室注射siRNA研究脑缺血的凋亡机理)2.Matrix Biol. 2013 Mar 5.Transdermal siRNA-TGF1-337 patch for hypertrophic scar treatment.(皮肤涂抹siRNA研究治疗皮肤瘢痕)3.J Cereb Blood Flow Metab. 2013 Jan 9.SirT1 mediates hyperbaric oxygen preconditioning-induced ischemic tolerance in rat brain.脑室注射siRNA研究脑缺血机理)4.Cancer Lett. 2012 Jan 28;314(2):223-31. Epub 2011 Oct 5.NIRF is frequently upregulated in colorectal cancer and its oncogenicity can be suppressed by let-7a microRNA.(皮下肿瘤注射miRNA研究治疗结肠癌),.5.BMC Infect Dis. 2012 Aug 6;12(1):177.Short hairpin RNA targeting 2B gene of coxsackievirus B3 exhibits potential antiviral effects both in vitro and in vivo.(尾静脉注射DNA研究治疗病毒性心肌炎)6.Curr Pharm Des. 2012 Sep 25.MicroRNAs (miRNAs) in colorectal cancer: From aberrant expression towards therapy.7.Progress in Modern Biomedicine 2010 Sep.Anti-Virus Research on Short Double-Stranded RNA in Mouse Models with Viral Myocarditis. 10、再问一下，你们试剂的原理是什么，使用方法麻烦吗？1）体内转染试剂Entranster-in vivo是采用纳米技术合成的高分子化合物，通过物理作用与核酸结合，浓缩包裹核酸，从而保护核酸免受免疫系统破坏，同时将核酸富集在细胞表面，保护促进核酸进入细胞组织发挥作用。不含任何动物来源成分，由于处于纳米尺度，粒径小，不易引起免疫反应，不影响动物和器官组织的功能，可以多次在同一动物注射。 2）使用方法非常简单，几天就可以出结果。 第1天：将RNA或DNA与转染试剂混合，注射动物。 第2天或稍长：动物常规生长。 第3天或稍长：效果检测(PCR，Western Blot，病理，生理等)。 如此说来，从学术研究看，动物RNAi的工作量还是蛮大的，并不比KO少。 还是传统的KO结果清楚，也容易解释。 例如，一些基因属于Haploid Insufficiency， 动物RNAi可能就无法弄明白。 不过在应用研究上，尤其是在小鼠以外的动物身上，动物RNAi还是可以试一试。 关于动物体内转染和KO(基因敲除)比较，基因敲除确实有其优势，可以在动物中长期存在某基因的缺失。但基因敲除，也有这样的问题，就是敲除的基因会在动物的全身存在，不利于局部的研究。即使针对同一个基因，各个实验室基因敲除产生的动物也可能有差异，不利于实验的重复。动物体内转染对动物的依赖很少，很容易重复。基因敲除的时间周期也很长，而且由于其不可替代性，饲养要求高。基因敲除动物的数量有限，费用高，不利于大规模的筛选和评估。动物体内转染可以做大量动物，避免了个体差异，饲养操作等误差，实验容易重复，而且可以随时更换基因，进行上下游研究，非常灵活。由于KO动物的相对来之不易，所以实验数量少一些，可能从这个角度看，工作量少。实际KO的工作量一点都不少，包括前期的准备，KO动物的构建，KO动物的鉴定等等。关于Haploid Insufficiency(单倍体功能不全)，一般指等位基因的2个拷贝中，其中一个拷贝由于突变等导致产生的蛋白数量减少或功能不全，实际就是该基因功能的部分失活(不全)。KO动物往往可能存在这样的问题。Haploid Insufficiency(单倍体功能不全)和RNAi在效果上是类似的。研究Haploid Insufficiency(单倍体功能不全)，多不需要再采用动物的RNAi，而是需要采用动物的基因表达，也就是转DNA到动物，以增强该基因的功能，这个也是动物体内转染的一部分。动物体内转染目前在小鼠上应用较多，主要是小鼠成本低，而且容易获得和操作。KO动物主要是鼠，也是这个原因。 11、请问体内转染可以转染肺组织么？转染肺组织是没有问题的。12、是直接通过气管内注射？转染肺有2种方式，1.是通过气管灌注，需要做气管切开。2.通过静脉注射。这2种方法都可以，区别是：气管直接灌注效果更好，而且用量较少，可以做较大动物，比如兔。但需要麻醉动物进行气管切开，放置气管导管，方便给药。通过静脉给药，相对用量较大，一般做小动物，比如鼠。13、转染的基因过表达能够维持多长时间？如果进行基因的过表达，一般可以维持2周。如果需要长时间维持，可以进行多次给药。14、可以直接用于关节内软骨相关基因转染么，如何转染？直接关节腔注射还是尾静脉注射？关节内软骨相关基因的转染相对难一些，尤其是转DNA，但可以使用。一般采用关节腔注射的方法。15、我想请问一下你们这个转染试剂多少钱？我想直接瘤内注射是否可以？瘤内注射不管是DNA还是RNA效果都不错，而且用量花费很少。这里只技术答疑，关于价格，已发站内信息。16、太好了，找到专家了！请教几个问题，体内转染用慢病毒效果好吗？目的组织是心肌，是尾静脉注射好呢还是心肌局部注射好？科研实验，有很多方法可以选择，各种方法都有其成功的应用者，各种方法殊途同归，从这个角度看，各种方法都可以采用，各种方法都可能失败，效果的好坏和很多因素有关。单纯从方法看，之所以不同的研究者采用不同的方法，多从以下因素考虑：.实验方法是否成熟（是否有文献支持）；.方法是否易于操作，如同解数学题，有的方法需要10步，有的需要2步，多种方法都可以成功，如果10步的方法，每步都很熟，都能保证不错，结果也会成功，当然，2步的方法，由于过程少，更易操作和成功。.方法是否节省时间和经费。相信很多研究者都是在考虑平衡到上述因素后，评估当时能采用和利用的最佳方法后进行的研究。还需要说明一点的是，单一一种方法，有时会有其系统误差，所以很多高质量的文献重要的实验采用的方法都不只一种，就是为了避免“孤证”的产生。 关于心肌的体内实验的注射途径的问题，尾静脉注射和心肌直接注射的文献都有报道，说明这2种方法对应用者来说都不错，这和前面的问题类似，2种方法涉及不同的技术。心肌局部注射，一般注射到心包，直接作用到心肌，试剂用量少，缺点是需要掌握心脏注射的技术，老鼠易死亡。尾静脉注射，技术简单，但试剂用量大，花费可能高。总之，需要根据实验室和课题的具体情况，平衡各种因素，一般在有成熟的应用经验（文献支持）基础上，首先采用方法简单的，过程少的，实验成功概率大的，在成功的基础上，可以再才用其它方法进行验证，这样得出的实验结论才更可靠，更有说服力，文章也更容易