氨基酸衍生与高效液相色谱分离

氨基酸衍生与高效液相色谱分离 作者姓名（北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，）摘 要 高效液相色谱(HPLC:High Performance Liquid Chromatography)是生物化学、分子生物学学科领域与专业最为重要的分离分析技术，具有分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广等优点。由于氨基酸对人类生活的重要性，氨基酸分离分析一直是分析领域的重要课题。运用邻苯二甲醛(OPA)进行氨基酸的衍生化，产物过高效液相色谱，完成氨基酸的分离。关键词 高效液相色谱；氨基酸衍生化；氨基酸分离氨基酸均为伯胺，可以对邻苯二甲醛的醛基进行亲核加成生成醇胺，然后脱水生成席夫碱。在碱性（PH=9.5）和强还原剂（如硫基乙醇）存在的条件下进一步反应生成氨基酸衍生物，在338nm处可检测出峰。HPLC系统大致由贮液器，脱气装置，色谱柱及柱温箱，色谱泵，进样器/进样阀及检测器组成。本实验采用反相色谱，即固定相为非极性，流动相为极性。HPLC的分离原理是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。1 材料和方法1.1 材料缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸标准品，邻苯二甲醛(AR)，-巯基乙醇(AR)，硼酸盐缓冲溶液(0.4mol/L， pH 9.5)。衍生化试剂：称取邻苯二甲醛 0.0500 g，用 1 mL 甲醇溶解, 加入100uL 巯基乙醇，用 0.4 mol/ L 硼酸溶液(pH = 9.5，氢氧化钠溶液调制)定容至 10 mL，混匀，置于暗处，每隔 1 天补加10L巯基乙醇， 每周需重新配制。氨基酸样品溶液：单标样品为取三种氨基酸样品10 mg分别溶于10 mL超纯水中，4保存备用。混标样品为各取三种氨基酸样品10 mg溶于10 mL超纯水中，4保存备用。岛津 SPD-M20A VP 型高效液相色谱仪。1.2 方法（1）色谱条件：色谱柱：ODS柱(柱径2504.6mm)流动相： 醋酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH 6.4) : 50%乙腈溶液 65 : 35检测波长：338nm流速：0.8 ml/min进样量：20L（2）高效液相色谱仪操作步骤：1)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3)打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4)进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5)有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。6)调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。7)设计走样方法。点击file，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。8)进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。按进样操作进样：先将进样针送入针孔，而后转换六通阀到inject档位，迅速平稳注入试样，转回六通阀，抽出针筒。所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9)关机时，先关计算机，再关液相色谱。（3）实验时，将各样品进行衍生化并依次过柱检测，按照指导保证全部出峰后进行下一个样品的检测。样品检测完成后，检测待测混合氨基酸试样。而后将峰图结果用离线模式进行分析处理。2 结论2.1 OPA（衍生化剂）谱图2.2 各氨基酸样品谱图Glu谱图：Asp谱图：Val谱图：Ala谱图：2.3 混合试样谱图2.4 结论由以上色谱图可得出以下结果：衍生化剂呈现保留时间3分18秒的一个峰，各氨基酸样品谱图均存在此干扰峰，应当忽略。Glu（谷氨酸）色谱结果为一个单峰，保留时间约为4分15秒。Asp（天冬氨酸）色谱结果包含一个明显的峰，保留时间约为2分34秒。Val（缬氨酸）色谱结果包括两个保留时间分别为17分26秒与22份8秒的两峰。Ala（丙氨酸）的色谱结果可以分辨出16分40秒与22分47秒的两处峰。混合试样显示出多组峰，可以分辨出2分30秒左右存在一条峰，4分左右存在一条峰，同时在16分40秒及21分18秒左右各有一条明显的峰出现。根据这些峰，可以推断试样中存在谷氨酸，天冬氨酸，可能存在缬氨酸与丙氨酸。3 讨论3.1 由结果可以看出，与谷氨酸相比，天冬氨酸的保留时间更短，这是因为谷氨酸比天冬氨酸多出一个亚甲基，疏水性更强，在此色谱条件下与固定相结合更紧密，所以保留时间才会更久。 丙氨酸与缬氨酸均为中性脂肪族氨基酸，二者结构也有相似之处，同时丙氨酸与缬氨酸的峰面积都很大，很容易互相掩盖，在此条件下不能进行区分，故无法判断混合试样的准确成分。当然根据试样配方，我们可以知道此时是缬氨酸出峰，出峰时间也大致吻合。3.2 每个氨基酸的衍生结果均为一组峰，可以通过综合比较的方法判断是否具有该氨基酸的峰。采用调整混合试样的浓度比，或者改变色谱条件的方法，可以将缬氨酸与丙氨酸区分开。参考文献：1 王利, 张亚东, 薛永. 岛津LC-10AT型高效液相色谱仪常见故障及解决方法J. 中外健康文摘, 2010, 07(34).2 朱智甲. 邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法测定水牛角中氨基酸的含量J. 分析化学, 2000, 28(5):609-612.3 邓樱花, 王舟, 陈功轩,等. 反相高效液相色谱分离五种常见的氨基酸J. 广州化工, 2013, 41(6):110-112.4 唐涛. 氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应