实验3、植物染色体标本制备及核型分析---辅助资料

实验3、植物染色体标本制备及核型分析目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura 和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。一、实验目的1、掌握植物根尖、茎尖及叶片去壁低渗染色体制片技术，通过3周开放性实验教学，进行植物染色体制片技能训练；2、掌握植物染色体显微照象技术及组型分析技术，通过大量的制片观察，能获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型制片；通过显微摄影，获得某植物染色体自然核型图，并能用国内外通用的植物核型分析标准，确定该植物染色体模型图、核式公式及类型；3、掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像，收集核型分析及有丝分裂过程观察的染色体制片素材；4、结合实验，对某一新资源植物进行染色体组型分析，获得该物种染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图。二、实验内容1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、低渗、酶解、固定、制片、染色等去壁低渗染色体制片全过程，并获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片；2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某新资源植物种典型的染色体图象照片40张，并从中挑选确定，被用于核型分析的染色体自然核型图5张；3、植物染色体核型分析技术训练，用国内外植物染色体核型分析标准，确定该新资源植物种的染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图；进行该新资源植物种染色体核型分析，力争能将该新资源植物实验结果，撰写成一篇研究小论文，或一篇能发表的研究论文；4、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。三、实验材料1、蚕豆根尖，2n=2x=12;2、某新资源植物茎尖、幼叶或子房，如显齿蛇葡萄、泥蒿、鱼腥草等有开发潜力的新资源植物种的茎尖、幼叶或子房。四、实验器材1、设备：普通生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、NIKON数码相机、计算机图象处理系统、培养箱、恒温水浴锅、喷墨彩色打印机等；2、用具：载玻片、盖玻片、眼科镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、试剂瓶、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、玻片标签纸等；3、药品：8羟基喹啉、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰乙酸、纤维素酶、果胶酶、对二氯苯、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钡、甘油、盐酸、胰蛋白酶、尿素、氯化钙、EDTA、Giemsa、洋红、地衣红、卡宝品红、锡夫（Schiff）试剂。附试剂配制0.002mol.L-1 8羟基喹啉配制：取8-羟基喹啉0.29g，先用少许乙醇溶解，用鲜蒸馏水定溶1000ml。0.01%秋水仙素配制：称取1g秋水仙素，用少许乙醇溶解后，用鲜蒸馏水定溶至100ml。饱和对二氯苯溶液配制：鲜配鲜用，称取5g对二氯苯结晶，用40-45蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1 h，取上清液，10-20下预处理。0.075mol.L-1KCL溶液配制：称KCL 5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。2.5%混合酶配制：常用浓度2.5%，取纤维素酶、果胶酶各1g，分别溶于20mL蒸馏水中，配成5%的纤维素酶及果胶酶，再等量混合，配成2.5%浓度混合酶，溶后用0.1 mol.L-1 盐酸或0.1 mol.L-1 NAOH调pH值为5.5左右，鲜配鲜用或棕色瓶4下保存备用。2XSSC溶液配制：2XSSC溶液即0.3 mol.L-1 氯化钠与0.03 mol.L-1 柠檬酸钠Na3C6H5O7溶液。称氯化钠17.53g, Na3C6H5O7 8.8233g,加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。Sorensen磷酸缓冲液配制。A液：0.067mol.L-1磷酸二氢钾溶液，称取KH2PO4 9.118g，用少许鲜蒸馏水60下溶后，定溶至1000ml。B液：0.067mol.L-1磷酸氢二钠溶液，称取Na2HPO.12H2O,23.995g,用少许鲜蒸馏水60下溶后，定溶至1000ml；根据使用时pH值的要求按下例比例混合。pH值：6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4A液： 68.7 62.8 57.0 51.0 44.8 38.8 33.0 27.6 22.3 18.2B液： 31.3 37.2 43.0 49.0 55.2 61.2 67.0 72.5 77.7 81.8Giemsa母液配制：取Giemsa 1g，甲醇66ml，优质甘油66ml；先将Giemsa加适量甘油充分研磨60min，无颗粒时倾尽全部甘油充分磨匀，然后在56下，保温2h，冷却后再加入甲醇（GR或AR），充分混合，盛入棕色瓶内，4下保存备用，保存的时间越久越好。Giemsa染液：染色前鲜配鲜用，按Giemsa母液：Sorensen磷酸缓冲液=1：10稀释后用。45%醋酸溶液配制：95%冰乙酸，稀释成45%浓度。所需浓度（45%）=冰乙酸体积溶液体积=45ml冰乙酸0.95（45+50），0.1mol.L-1盐酸溶液配制：用滴定管量取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至1000ml。 饱和氢氧化钡溶液配制：鲜配鲜用，称取5-8g氢氧化钡，用100mL煮沸的蒸馏水溶解，振摇充分溶解，待冷却后过滤，配成5%-8%的饱和氢氧化钡水溶液1mol.L-1磷酸氢二纳溶液配制：称取Na2HPO.12H2O156.01，用少许鲜蒸馏水60下溶后，定溶1000ml。0.85%生理盐水溶液配制：称取0.85g氯化钠溶于100ml蒸馏水中。0.01%胰蛋白酶溶液配制：取活性单位1：250胰蛋白酶0.1g，Hank液100ml，先用少许Hank液溶解胰蛋白酶，然后再将余液加入，置于37水溶液中溶解1h，（时间长短取决于溶解度，待溶液全部透切清凉为止）。溶解后用除菌过滤器过滤，无菌分装，密封，贴好标签，置于-20冰箱中保存，使用前用0.1 mol.L-1 NAOH调pH值为7.6-7.8。Hank原液配制：称取1.4g氯化钙溶于30-50ml的重蒸馏水中；取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先加入重蒸馏水800 ml于烧杯中，再分别称取氯化纳80.0g、Na2HPO4.12H2O，0.6g、氯化钾4.0g、KH2PO4 0.6g、MgSO4.7H2O 2.0g、葡萄糖10.0g（含1分子水时为11.0g），均在前一药品完全溶解后，方可加入后一药品，直到完全溶解后，定溶至1000ml；用滤纸过滤后，加入氯仿2ml防腐，充分混匀后，分装，贴好标签，4下保存。Hank缓冲液配制：Hank原液100ml，重蒸馏水896ml，0.5%酚红4ml，混匀后，在5.28104Pa下灭菌，4下保存。使用前用0.1 mol.L-1 NAOH调pH值为7.6-7.8。Dhank溶液或0.02%EDTA钠盐溶液配制：氯化钠8g，绿化钾0.20g，磷酸氢二纳0.073b，磷酸二氢钾0.20g，无水葡萄糖2.00g，EDTA20mg。重蒸馏水加至1000ml。铁醋酸洋红染液配制：先将50 mL 45%的醋酸水溶液放入150mL的锥形瓶中煮沸，然后慢慢地加入0.5-1g洋红粉末（注意不要一下倒入，以防溅出），过1-2min后，加入一锈铁钉，再过几分钟后取出铁钉（使染色剂略含铁质，以增强染色性能），继续用微火加热1h后，冷却过滤，即可使用，保存于棕色瓶中（避免阳光直射）。如无洋红也可用地衣红代替，配制方法同前。此液常用于植物细胞核，特别是花粉母细胞的涂抹和压碎法染色，效果良好。席夫（Schiff）试剂配制：称0.5g碱性品红溶于煮沸的重蒸水（或蒸馏水）中，搅动使充分溶解，冷却至50时，过滤于棕色细口瓶中，加入10mLlN HCl，冷却至25左右，加入1g偏亚硫酸钾或钠（Na2S2O5或K2S2O5），振荡使溶解，密封瓶口，置于黑暗和低温处过夜，次日检查，如染色液透明无色或呈淡茶色，即可使用。如颜色较深，可加入少量优质活性炭（0.5-2g），振荡1min，置4冰箱中过夜，经过滤后即可使用。此液配好后，应紧塞瓶塞，外包黑纸，贮藏于冰箱中。卡宝品红（Carbor fuchsin）试剂的配制: 称3g碱性品红，溶于100ml70%的乙醇中，称为A原液（此液可以长期保存），取10mlA液，加入90ml15%的石碳酸溶液（两周内使用），称为B原液。使用前，取B原液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8克山梨醇，充分溶解后备用。此液适用于植物核型分析、染色体形态观察。五、实验原理凡是细胞处于活跃增殖状态或经过某种实验处理后进入细胞分裂状态的任何植物组织，如植物根尖、茎尖、幼叶、花蕾、幼花粉、幼胚、核型胚乳、愈伤组织、居间分生组织、茎形成层等细胞分裂状态的植物组织均可以作为染色体分析的实验材料；通过8-羟基喹啉、秋水仙素、对二氯苯等预处理药剂处理，来降低细胞质的粘度，促进染色体缩短分散，障碍纺锤体形成；通过纤维素酶、果胶酶酶解去壁，使分生细胞的原生质体能从细胞壁里压出来，经过精心制片，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量的细胞质，获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象。各植物种的染色体数目都是恒定的，二倍体植物体细胞内都含有两组相同的染色体(chromosome)，每一条染色体都有两条染色单体（chromatids）。细胞有丝分裂时，每一条染色单体分向细胞两极，形成子细胞；细胞分裂间期染色单体复制，纵裂并向的两条染色单体往往通过着丝粒（centromere）联在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的，呈现出一个淡染色区间。着丝粒的两端是染色体的“两臂”，着丝粒不在中央的染色体，就必然有长臂（q）、短臂（p）之分。由于着丝粒位置不同，可以把染色体分成中部着丝粒染色体（m）、近中部着丝粒染色体（sm）、近端部着丝粒染色体（st）及端部着丝粒染色体（t）。有些染色体除了着丝粒之外，还有一段稍窄的淡染色区，叫次缢痕；次缢痕的远端突起，为随体（satellite）。所谓核型（karyotype）就是指：一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来，所构成的染色体图象；通常是将显微摄影得到的染色体照片粘贴或染色体核型分析系统软件处理生成的染色体图象。所谓组型（idiogram）就是指：通过许多细胞染色体测量，取其平均值绘制成的染色体模式图；通常是用染色体相对长度（relative length）、臂指数（am index）、着丝粒指数（centromere index）等形态特征参数来描述染色体模式图。人类染色体研究早在1960年就召开了专门的国际会议，确定了人类染色体核型分析的国际标准，即Denver命名标准；但植物染色体核型分析至今还没有一个专门的国际标准；1984年8月，我国第一次全国植物染色体学术讨论会上，李懋学、陈瑞阳（1984）所作的“关于植物核型分析的标准化问题”报告，经过与会代表的充分讨论，成为大家的约定标准，被同行所承认。由于染色体是基因的载体，核型代表了种属的特征，所以染色体组型分析对于探讨植物生命奥秘、生物起源、物种间亲缘关系、远缘杂种鉴定等方面都有重要意义。六、实验方法（一） 植物染色体制片技术及方法1、 正确取材一般来讲，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可以作为染色体制片材料；如根尖、茎尖、幼花、幼胚、愈伤组织及正在分裂的大、小孢子母细胞等；正确取材就是强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，材料新鲜、尽可能是活材料。根尖用能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜；植物根尖不同部位的细胞，其分裂细胞频率有明显的差别；根冠是由不同分化程度的薄壁细胞组成，且常含淀粉粒，根冠细胞已经停止细胞分裂，染色体制片时应该切除根冠；但因根冠很容易识别，且根冠后1-2mm长的根段就是根尖分生区细胞，所以，根冠是确定根尖分生细胞区的重要标志；染色体制片时，比较重视能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜。根尖分生细胞区多为等直径的分裂细胞，其细胞质浓，细胞核大、细胞核体积约占整个细胞体积的3/4，是染色体制片的好材料；染色体制片取材如果不是在根尖分生细胞区取材，即使制片全过程每一环节都作得很好，也是徒劳的。根尖分生区上端是伸长区，该区的细胞主要是细胞体积增加，基本上已停止分裂。所以，根尖染色体制片的取材部位是根冠末端1-2mm的根段为宜。以洋葱为例，根冠区约0.5mm，分生区12mm，3mm之后为伸长区（图9-1）。物种不同根冠及分生区的长度也不同，一般而言，用于染色体制片的根尖长度，以根冠末端1-2mm为宜。图9-1 洋葱跟尖纵切面，各部分细胞分裂的频率差异植物体细胞染色体的研究中，根尖分生组织是主要的染色体制片材料；因为它取材方便，分生区易于区别，如果用种子发芽取根，还不受季节的影响，这是其他材料所不及的。根尖材料获得的方法很多，常有种子发芽、鳞茎水培、扦插取根、引发气生根等。种子萌发取根：生长健壮的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也比较平直，也就是所谓的“硬染色体”；而根尖生长势差的材料，不仅细胞分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，也就是所谓的“软染色体”。所以，种子萌发取根，不仅要求种子的饱满度、生活力等品质性状好之外，还要求种子萌发条件最佳，获得最佳的“硬染色体”。鳞茎水培：洋葱、水仙、蒜、风信子等材料多用此方法；在水培过程中，注意经常更换新鲜的同温水，是获得良好材料的关键。扦插取根：扬、柳、桑、葡萄、菊花等扦插繁殖植物多用此方法；在扦插繁殖过程中，注意保湿通气，可以获得良好的根尖材料。茎尖用能见生长锥的茎尖材料作为实验材料比较适宜；茎尖一般包括有生长锥和叶原基两部分，广义上讲的芽，还包括有幼叶和腋芽原基。生长锥是茎的顶端分生细胞组织区，不同植物或同一植物的不同发育阶段，其生长锥的大小和形状都有较大的变化，他们可以是下凹、园丘、园锥或极端伸长（如禾本科）等多种不同的形状；生长锥的宽度，因物种不同也不同；丁香生长锥宽度40m，苏铁生长锥宽度达300m。生长锥不同部位的细胞，其细胞分裂的频率及细胞周期长短有明显的差异。一般来讲，生长锥则面的叶原基细胞比生长锥中心区细胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗罗生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为76、36h，菊花生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为140、70h。也就是说，生长锥则面的叶原基细胞也是染色体制片取材的好材料。茎尖取材以生长锥顶开始1.0-1.5mm为宜，休眠芽不宜用作染色体制片的材料。茎尖取材工作是比较繁复的，需要细心地剥掉全部幼叶，用扩大镜观察，能见生长锥时方可（图9-2）。9-2 茶叶叶芽纵切面图物种不同，生长锥的形状及宽度，因物种不同也不相同，且易受季节影响；所以，茎尖取材技术难度比根尖取材技术要高。茎尖的正确取材，更需要强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，应在扩大镜下，尽可能地剥除幼叶、尽可能地减少木质分子结晶的干扰。幼叶幼叶是叶原基顶端分生细胞继续分裂发育形成的小叶，其发育早期主要是细胞分裂使叶原基伸长、增加体积、形成叶轴，所以幼叶可以作为染色体制片的材料。幼叶的分生组织，按其分布位置可以分为顶端分生组织、近轴分生组织、边缘分生组织、居间分生组织及板状分生组织等。一般来讲，顶端分生组织的细胞分裂使整个叶原基伸长、形成锥形的叶轴（图9-3），是没有分化的细胞，但其分裂活动停止较早；居间分生组织的细胞分裂活动停止较晚，是染色体制片取材的好材料；边缘分生组织的细胞分裂形成扁平的叶片，其分裂活动依物种叶片厚度不同而不同。幼叶的取材大小，依物种而异，但总原则是幼叶越小越好，一般以含有叶轴的幼叶510mm长为宜，子叶则以1.53mm为宜。图9-3 烟草幼叶顺序图解花蕾花蕾是指花芽分化始期至减数分裂之前的幼蕾，包括花辨原基、雌蕊原基及雄蕊原基正在细胞分裂的花芽（图9-4）。图9-4 桃的花芽分化花蕾是仅次于根尖染色体制片的理想材料，它的最大优点是在植物孕蕾阶段，可以直接从植株上取得大量的制片材料，幼小的花药和子房，往往比根尖更便于制片操作，且细胞分裂指数比根尖材料高；花蕾的取材时间，通常需要定期镜检作出选择，其方法是取幼小花药或子房在植物孕蕾期，多数植物在开花前10d以上；其方法是取含有幼小花药和子房的小花35mm左右方可。花粉是指花粉母细胞减数分裂后，所形成的小孢子至发育成为雄配子体过程中的花粉粒，植物小孢子形成后，要经过1-2次有丝分裂，形成具有两核或三核细胞花粉。如百合科、石蒜科、鸭跖科、茄科等植物为两核细胞花粉，禾本科、菊科等植物为三核细胞花粉，极少数植物是两核和三核细胞兼有，如堇菜属植物。利用小孢子有丝分裂过程来观察染色体，有独特的优点：其一、是染色体数目减半后的细胞，染色体数目是单倍数，为染色体记数或核型分析提供了极大的方便；其二、花粉分裂细胞数目多，可以同时获得大量的实验材料；其三、一般都不需要进行预处理和细胞解离，操作简便。因此，对难以获得种子或种子发芽困难的植物来说，是比较理想的材料来源。取样时间，与减数分裂取材时间相当，多数植物在开花前312 d，主要以植物的某些形态特征为参考依据。如小麦在麦穗伸出旗叶1-4cm,玉米雄花序抽出3cm左右，棉花花蕾10-13mm,芍药花蕾直径1.5-2cm,银杏花药呈黄绿色时等形态特征，都是处于减数分裂后第一、二次有丝分裂时期，是染色体制片最佳取样时期。愈伤组织是指人工培养条件下产生的愈伤组织。在一块愈伤组织中，细胞分裂比较集中的部位，通常难以确定，受培养条件的影响较大，因此，准确取材比较困难。一般来讲，以转移到新鲜培养基上，经3-7天培养后的材料比较适宜；在解剖镜下观察，细胞个体小，细胞核大，细胞质浓的愈伤组织分生细胞是染色体制片最佳取样材料，而细胞体积较大、比较疏松透明的细胞群，因细胞老化，而难以获得理想的染色体。2、预处理目的及作用：植物有丝分裂中期染色体高度浓缩，形态和结构都比较清楚，但因纺垂体的作用，染色体紧密地排列在赤道板上，很难将其分开,尤其是染色体数目较多的植物材料，很容易产生染色体严重重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅10-30min，使中期染色体细胞出现频率不高。为了克服上述矛盾，常用化学或物理方法对材料进行预处理。这些方法的作用机理及其作用是：阻止或破坏纺垂体微管的形成，由于没有纺垂体的作用，细胞有丝分裂过程，被阻抑在细胞分裂中期阶段，从而累计比较多的处于细胞分裂中期的染色体图象。促进染色体浓缩变短，减少染色体之间相互缠绕重叠，有利染色体的高度分散。改变胞质粘度，促进染色体清晰，促进细胞质清洁。所以预处理是否适宜，是染色体制片技术中最关键的操作步骤；如果预处理的效果良好，即使是初学者也不难制作出优良的染色体标本，反之，如果预处理失败，即使是很有经验的人也难以制作出好的制片。处理药剂可以用作染色体预处理的化学药品，主要有生物碱、甙类、酸类及其他物质；最常用的化学药品有秋水仙素、8羟基喹啉及对二氯苯。秋水仙素（Colchicine）：是从石蒜科秋水仙素属秋水仙(Colchicum autumnale)种子或鳞茎中提取的一种生物碱，其分子式为C22H25NO6+1.5H2O，分子量为399.45。纯秋水仙素为针状结晶，商品多为白色或淡黄色粉末,融点155，易溶于水、酒精、氯仿及甲醛中,但在热水中的溶解度差，不溶于苯。剧毒,易引起眼睛失明或中枢神径麻醉，使用时一定要要注意安全。秋水仙素预处理的有效浓度为0.001-1%，常用浓度为0.05-0.2%。8羟基喹啉（8-hydroxyquinoline）：白色结晶或粉末, 其分子式为HO8H3N：CHCH：CH，分子量145.17。溶于酒精，难溶于水,需60、23h才完全溶解。8羟基喹啉不仅具有秋水仙素的预处理的效果，而且所显示的染色体缢痕及随体的结构，往往比秋水仙素更为清晰，尤其在处理中、小型染色体比秋水仙素好，能使染色体、缢痕及随体的图象更清晰。常用浓度为0.002mol/L，少数学者使用0.004mol/L浓度，但使用者不多。对二氯苯（p-dichlorobenzene）:为一种苯的衍生物，其分子式为C6H2CI2，分子量为147.00。商品对二氯苯为无色结晶，大块时呈白色，具有特殊臭味，常温下可以升华挥发；易溶于乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，难溶于水；易燃、有毒，通常用作防腐剂。对二氯苯比秋水仙素远为价廉而易得，药剂配制及使用方便，易于广泛使用。对二氯苯在水中的溶解度很低，多用饱和水溶液进行预处理；所以，对不同植物预处理时仅需要考愈处理的时间长短，不需要考虑浓度。对二氯苯应用范围广泛，对大染色体、小染色体植物预处理都有效。对二氯苯不仅对纺锤体微管的组装有较强的阻抑作用，还可能对其他微管蛋白或某些细胞器有分解作用，能很大程度上改变细胞质粘度，称之为细胞质清除作用。因此，使染色体易于分散，尤其是对染色体数目多的细胞，染色体分散效果好。但对二氯苯对细胞代谢活动有较大的毒害作用，预处理温度太高或时间太长，都容易导致染色体断裂、粘连等类似于辐射畸变的效果，曾被用作植物的化学诱变剂。因此，严格控制预处理时间、温度条件是非常重要的。一般采用鲜配鲜用的方法，即称取5g对二氯苯结晶，用40-45蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1 h，取上清液，10-20下预处理。处理方法预处理的方法往往容易被忽视，但预处理失败的实验多是预处理的方法使用不当而致。就材料本身而言，预处理的方法有离体处理、非离体处理和低温三种。离体处理：即将处理器官或组织从母体上切除下来，浸没在预处理液中。该处理方法的主要特点是药物作用迅速，短时简便，良好的预处理效果是在细胞的某些合成作用受到抑制，而前期分裂过程又能正常进行的条件下获得的。由于被处理的材料小，离开了母体，细胞代谢的能源被中断，加上处于严重缺氧和有毒的恶劣环境中，一旦处理时间太长或毒害太大，细胞将会因缺氧中毒、死亡。所以，预处理的技术性强，操作要求高。多用培养皿铺2层滤纸，加一浅层预处理液，均匀摆齐，让少部分材料能露出预处理液的液面，也可以用指形管沉没材料的方法进行处理。一般来讲，提高预处理效果，应该做到：被处理的材料忌多，根尖或茎尖每管不超过15个，每皿不超过30个；切取的材料忌大，根尖或茎尖长23mm；注意避光通氧，采用经常更换预处理液或振摇的方法完成预处理过程；预处理温度不宜太高，20为宜，一般不超过25；预处理时间依物种不同而不同，一般13 h。非离体处理：预处理材料没有与母体分开，仅仅是把要预处理的部分浸入预处理液中，如带有种子种根、鳞茎、根状茎、茎节的根尖，只将根尖分生区浸没在预处理液中进行处理。由于分生组织没有离开母体，耐药抗毒性强，允许延长相应的处理时间，但也正因为如此，药物的作用也相应减慢。所以，处理的持续时间便随之延长。如果处理得当，非离体处理比离体处理积累的中期分裂细胞更多。非离体处理的药物多是秋水仙素，因预处理时间过长，则可能导致染色体数目加倍，产生多倍化细胞。处理的方法是，把分生区组织浸没在预处理液中，20条件下，多数植物一般不超过25，大染色体类型材料处理1220 h、小染色体类型材料处理45 h。如果需要将预处理材料保存7天以上时，用非离体处理比较好。低温处理：低温也可以阻抑纺锤体微管的组装，与预处理药物有异曲同工的效果。但是，低温作为一种预处理的方法，并不能适用于所有植物。这是因为不同植物的分生组织细胞对低温的反应是不同的，其细胞的合成、代谢及分裂都有不同的临界低温，尤其在离体条件下情况十分复杂。至今，用低温预处理获得较好效果的报道仍然很少。成功的例子主要是禾本科农作物，如小麦、黑麦、大麦用1-4低温，水稻、玉米用6-8低温预处理能获得较好的效果。低温也有抑制纺垂体形成的作用，将活体材料或离体材料浸入蒸馏水，置于4冰箱中处理20-40小时，有一定的预处理效果。3、前低渗目的与作用：自20世纪50年代在人类及哺乳动物染色体制备研究中的低渗和火焰干燥法发明以来，就有许多学者试图将人类染色体标本的0.075mol.L-1KCL低渗技术引入到植物染色体标本制备上，但都没有进展。直到1979年，陈瑞阳等人在前人工作的基础上，通过37科422个物种广泛试验，才创建了一套完整的去壁低渗技术。低渗的目的是促使分裂细胞膨胀，细胞膜的淋巴细胞膨胀，使染色体从细胞膜内释放出来，能使细胞质和染色体上部分蛋白质丢失。植物染色体标本制备中的前低渗，其主要作用有两个：促进质壁分离，有利于用酶去壁。促进细胞质粘度改变，有利于染色体图象清晰。为什么说前低渗是染色体标本制作的关键技术？处理药剂：一般多用氯化钾作为前低渗药剂，KCL为白色结晶,分子量74.67，易溶于水，常用浓度0.075mol.L-1，也可以用双重蒸馏水前低渗，但比氯化钾低渗效果差些。处理方法：去掉预处理液，用0.075mol.L-1氯化钾低渗液浸没材料，25下处理30min。如果因时间或工作的原因，需将预处理材料保存几天或一段时间，则前低液处理时间不宜太长，一般不超过10min(68min)，用甲醇：冰乙酸=3:1鲜固定液固定4h,转入75%乙醇，再转入50%乙醇中保存备用。酶处理之前，用蒸馏水冲洗多次，并浸泡30min。为什么要强调用蒸馏水多次冲洗、并浸泡后，再进入酶解去壁？4、酶解去壁目的与作用：Gill(1974)在压片前应用纤维素和果胶酶对细胞壁进行解离，Mouras(1978)等人用烟草愈伤组织经纤维素处理获得染色体，Omura和Kurata(1978)在水稻染色体研究中应用了纤维素酶、果胶酶处理取得了一些进展，陈瑞阳提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗方法。酶解去壁的作用：生物解离处理替代理化解离处理，减少了染色体变形、畸变，呈现出真实的硬染色体。去掉细胞壁纤维、果胶及胞质对染色体数量影响，使染色体分散空间更大。有利染色体着丝点随体等图象完整清晰。酶解去壁是染色体标本制备的关键技 术，因为它直接影响到单细胞的得率，酶解不足或过度都会导致染色体制片失败，被处理材料的大小、数目，酶的质量、浓度、pH值及处理温度都会影响到酶的处理效果。处理药剂：纤维素酶，有国产及进口两类商品；进口纤维素酶因纯度高，而价格贵；国产纤维素酶实用、价格便利，商品多为综色，1g装。果胶酶，也有国产及进口两类商品；国产果胶酶浅灰色粉末，10g装，均溶于水。常用浓度2.5%，100余个根尖约100mL2.5%纤维素酶及果胶酶液用量方可。处理方法：将纤维素酶及果胶酶按5%的浓度充分溶解，再按1：1等量混合，配成2.5%浓度混合酶，鲜配鲜用。吸除前低渗液后，加入混合酶液；25下处理24 h，因物种不同，处理的时间也不同，但均以被处理材料一触即破为度。处理结束后，注意酶液回收，4下保存可以再次利用；回收酶液的活性单位及浓度会有所下降，再次利用时，处理的时间会有所延长；需要10多小时处理时，应注意防止酶液干燥。5、后低渗目的及作用：后低渗是染色体分散的关键步骤，其主要作用是：使细胞吸水膨胀，让染色体随之分散到细胞质内，有利于染色体分散。新鲜双蒸馏水进入细胞，使细胞体积增大，细胞质浓度降低，有利于染色体标本清洁程度提高。后低渗处理时，混合酶已将分裂细胞的细胞壁酶解，原生质又充分吸水，所以细胞显得比较娇嫩，应该向被处理材料中加入（250.5）鲜双蒸馏水为宜。处理方法：混合酶液回收以后，用（250.5）蒸馏水清洗23次。如果用吸管回收酶液或吸掉清洗液时，被处理材料也有被吸出危险，应该放慢操作速度或者适当减少清洗次数。清洗完毕后，向被处理材料中缓慢加入新鲜双蒸馏水，浸没材料为度，（250.5）下浸泡30 min，让细胞吸水膨胀。后低渗处理后，常有悬液法及涂片法两种染色体标本制备方法。涂片法是先固定再涂片，被广泛使用，而悬液法是先制备细胞悬浮液再固定滴片。6、固定目的及作用：固定的主要作用是迅速杀死细胞，保留分裂图象。使染色体核蛋白变性、沉淀，呈现出染色体真实形态及结构。使细胞质原生质体蛋白变性、沉淀，有利于染色体背景清晰。处理药剂：卡诺氏：冰乙酸：无水乙醇=1:3，比较适宜于动物染色体标本制片；卡诺氏：冰乙酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6，比较适宜于油脂类含量较多的生物。冰乙酸：甲醇=1：3，通用于多数生物染色体标本制片，近来普遍采用。涂片制备法的材料固定方法：将低渗后的材料直接用固定液，固定30min以上。固定液宜鲜配鲜用，固定时间依物种不同而有些不同，固定30 min-20 h，材料粗大宜长，反之则反，4低温下固定的效果更佳，一般为30 min。7、涂片酶解效果好时，组织一触即破，多用涂抹制片方法。将材料放在预先洗净、用蒸馏水浸泡，并冷冻的清洁玻片上，滴一滴固定液，然后用镊子取一根尖留取分生细胞区，迅速将材料敲碎涂抹，并去掉大块组织残渣。酶解效果不好时，可以用镊子柄垂直敲打；滴45%醋酸1-2滴后，再次敲打，借助醋酸液表面张力把分裂细胞分开、把染色体引开，并除掉大块组织残渣。涂抹或敲碎涂抹制片的玻片均应自然干躁或火焰干躁。火焰干燥是指载有分裂细胞材料的载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干的办法，火焰干燥对分裂细胞有分色的作用。为了加强细胞分色，还可以在材料处滴加1滴甲醇冰乙酸固定液后，再火焰干躁，其细胞分色效果更好。火焰干躁时，玻片离火焰3cm左右，来回晃动，千万不要离火焰太近，防止炸片导致细胞破碎。涂片干燥后进入下一步染色。悬液法先制备细胞悬液：倒去后低渗处理的双蒸馏水，用镊子将材料挟碎、搅拌，形成细胞悬液，再固定、去沉淀及滴片：固定：向细胞悬液中加入鲜配的甲醇冰乙酸固定液1-2mL，置20min，细胞悬液中出现大块组织沉淀时，将上层细胞悬液，倒入另一个小瓶中，去掉沉淀物；去掉沉淀物的细胞悬液净置30min，能见细胞沉淀时，用吸管轻轻地吸去上清液，留1mL左右细胞悬液为染色体标本滴片备用。取一张预先洗净、用蒸馏水浸泡，并冷冻的清洁载玻片，用吸管滴2-3滴细胞悬液滴在玻片上，立即将玻片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干或自然干燥。8、染色目的及作用：染色的目的是尽量使染色体及细胞核染色，而细胞质不染色或淡着色，以便于观察。因染色体被染色，呈现出原有的形态结构及数目，能进行植物染色体核型分析；因生物染色体上富含AT或G=C碱基数量及分布差异或其它原因，经染色在染色体上可以产生着色深浅不同的染色体显带，为植物核型分析补充了一项很好的分类指标，进行染色体带型分析。常用药剂用于植物染色体染色的方法很多，各种染色方法都有其自身的特点及其适用的材料，下面简介国内外常用的几种染色剂。洋红（Carmine）：洋红是从胭脂虫(Coccus cacti)的雌虫中直接提取的一种染料，为非结晶的紫褐色物质。但因所用的胭脂虫的种类不同，洋红的品质也往往有些差异。在胭脂虫的提取物中加入铝或钙而成为深红色的洋红，洋红并不是真正的化合物，而是一种混合物。洋红中具有染色活性的洋红酸（Carminic acid），为一种二元酸，有一定比例能溶于水，在它的等电点Pp=4.0-4.5时几乎不溶于水。如果溶于等电点酸性的一边，则成为一种类似碱性染料的性质，可以使染色质着色；如果溶于碱性溶液中，则具有酸性染料的性质，可以使细胞质着色。洋红酸的染色能力不是很强，通常铁-乙酸洋红、乙酸-盐酸洋红、丙酸-铁-洋红。乙酸或丙酸洋红的配制和染色都比较方便，对细胞壁的穿透能力较强，能使染色体核仁均可以着色，很适于植物小孢子母细胞及小孢子的染色，但它的染色强度和分散效果不及其他染料。所以不及其他染色剂应用广泛，通常只作临时染色观察之用。地衣红（Orcein）：地衣红是从一种地衣红（Lecanora parella）及染料衣(Rocella tictoria)中提炼出来的紫红色染料。地衣红与过氧化氢、氢氧化氨作用，可以获得无色的母物地衣酸（Orceinic acid）,天然产物的地衣红与人工合成的地衣酸对染色体有同样的染色作用，但后者不如前者，地衣红溶于水及酒精，其配制方法与乙酸洋红相同，但无需加铁媒染，也无需回流（药剂配制见附录）。先配成2%母液，再稀释成1%后使用。地衣红对染色体及细胞核着色能力明显优于洋红，为目前国内外应用十分广泛的一种染色体和细胞核的染色剂。碱性品红（Basic fuchsin）：为一种三苯甲烷类的碱性燃料，商品碱性品红几乎都是由副品红（pararisaniline）或蔷薇苯胺（rosaniline）组成。碱性品红所含的所有成分均溶于水，更易溶于乙醇。碱性品红用于染色体染色，有两个重要的配方，即卡宝品红（Carbol fuchsin,也称苯酚品红或石炭酸品红）及锡夫（Schiff）试剂。卡宝品红，是目前国内外应用最为广泛的一种优良的核和染色体的染色剂，它既具有乙酸洋红的染色简便、快速的特点，又具有乎尔根（Feulgen）反应分色清晰的优点，且染色剂耐保存、稳定性好、制片色泽持久，这些都是前两种方法所不及的，该染色剂在我国的推广应用最为普遍。该染色剂配制后立即使用，染色较淡，放置2周后，染色能力会明显加强，而且放置的时间越长，染色的效果会越好。在常温下，此液可以存放两年而不会变质。卡宝品红对染色体的染色效果，与盐酸的解离条件密切相关，解离的时间太短，细胞质也会有不同程度的着色、分色效果不理想；在合适的解离条件下才有最佳的染色效果，染色体呈红色，细胞质无色或极淡红色，着色之前，最好将材料中的残余盐酸冲洗干净，否则卡宝品红将不易着色。锡夫（Schiff）试剂是Feulgen R与Rossonbeck H于1924年创造的一种DNA的细胞化学鉴定方法，也称为乎尔根（Feulgen）染色方法。锡夫（Schiff）试剂的配制，该方法的优点是只对细胞核和染色体着色，染色也比较均匀、背景清晰，但染色时间长，少数植物染色十分困难，因过度软化，而染色体分散困难。卡宝品红（Carbor fuchsin）: 卡宝品红是3%的碱性品红与15%石碳酸或45%醋酸等试剂配制而成，具有染色快、着色深、适应性广的特点，是多数植物根尖、幼芽、花药以及细胞愈伤组织染色的好染料。姬母萨（Giemsa）：最初用于DNA原位分子杂交(parldue, 1970)。随染色体分带技术兴起及发展，Giemsa染色愈加广泛应用。是一种含有不同氧化程度的噻嗪类复合染料，噻嗪类染料与磷酸基结合着色，有4个甲基亚甲兰和3个甲基天青A，2个甲基天青B协助噻嗪染料使染色体着色。因为它不仅仅使染色体着色，还可以把DNA复性过程中，DNA上“碱基种类(富AT，还是富Gc)，从着色带纹上区分，称染色体显带。Giemsa染色，因材料不同，着色速度差异很大，从几分钟到数小时不等。进化阶段低的植物种或固定时间长的材料易于着色，而进化阶段高的植物种或固定时间短的材料不易于着色。从染色体染色效果来看，上述四种染色剂中，染色效果最好的是Giemsa，其次是卡宝品红，依次才是地衣红、锡夫（Schiff）试剂、洋红。染色方法：因染色剂不同，染色方法也有些微小差异。但都有两种染色方法，其一、制片后玻片材料染色，一般都要待被染色材料干燥后，取染色剂染色。如取Giemsa、卡宝品红或地衣红染色稀释液，浸没材料区、严防气泡干扰，染色15 min或者更长一点的时间，稀释液的稀释倍数见药剂配制附录。待染色时间足够后，自来水冲洗玻片，注意水流量不能太大，冲洗时，材料面面对自来水缓慢冲洗；待多余染料冲洗完毕后，让染色体玻片自然干躁或火焰干躁，加盖盖玻片后，用显微镜观察。其二、材料整体染色，在染色体常规压片方法中还比较流行用材料整体染色方法，各种染色剂的整体染色方法见附录。Giemsa染色，一般按Giemsa母液：缓冲液=1：20稀释（pH为7.6时），浸没材料区染色15 min。地衣红染色，一般按母液：鲜蒸馏水=1：1稀释，浸没材料区染色15 min。上述1-8步都是用植物活体材料直接去壁低渗，再固定进行染色体标本制片的方法，称为活体材料制片法。为了方便野外材料采集，又提出了预先固定材料的去壁低渗方法，即需要染色体制片的材料，可以分批采集，经过预处理后就用甲醇冰乙酸固定，集中染色体制片的方法。如果采集的材料能在1周之内进行染色体制片，可以在甲醇冰乙酸固定液中保存，超过1周还不能进行染色体制片时，应把固定后的材料，用剃度酒精处理，保存在70%的酒精中，备用。预先固定材料的去壁低渗方法与活体材料直接去壁低渗方法，大同小异。大体步骤为：正确取材预处理甲醇冰乙酸固定前低渗酶解去壁后低渗涂片或悬液法滴片染色，方法同前。预先固定材料的去壁低渗方法与活体材料直接去壁低渗方法的比较：活体材料直接去壁低渗法的最大优势是活体原生质，半渗透性很好，吸水速度快，染色体因低渗作用而分散到细胞质内，所以染色体分散程度高，容易获得比较好的染色体图象。但它的不足之处是不便于野外材料采集，每一批材料采集后，都要立即染色体制片，需要制片的材料很多时，时间紧张，工作也显得比较累。预先固定材料的去壁低渗法的最大优势是方便野外材料采集，需要进行染色体制片的材料可以分批采集，集中染色体制片。但因先固定再酶解，细胞质失去半渗透性，染色体难以随低渗作用分散到细胞质内。所以，低渗吸水的时间需要很长的才会使细胞软化膨胀，染色体分散的效果也没有活体材料直接去壁低渗方法的好。9、实验观察染色体标本玻片干躁后，先用低倍镜找分裂细胞区，在分裂细胞区内寻找典型分裂相细胞。当找到含有红色条状物质的细胞轮郭图象后，再用高倍镜观察染色体，把染色体数目齐全、分散度高、重叠很少的图象，记录其染色体数目、坐标及图象，作实验报告，尽可能地观察到染色体的长臂、短臂、着丝点位置及某些染色体次缢痕、随体；图象十分清晰的玻片，在材料面右边帖上标签，说明材料名称，制片时间，工作者姓名。据实况加分，并交玻片。10、封片染色体标本玻片制好后如果来不及观察或照相时，需要暂时封存。暂时封存先在盖玻片四周各放麦粒大石蜡一块，再用烧热的解剖针迅速溶化石蜡，使盖玻片四周严密封闭。封好的玻片可放在冰箱内保存7-10天。如果玻片染色不太理想，可以水解或用固定液退色后，改用卡宝品红染色5-10min。发现有图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片后，应制成永久玻片，将玻片在二甲苯中脱水1小时，凉干后，在典型分裂图形处滴上1滴中性树脂或达马胶，盖上盖玻片封片，制成永久玻片。（二）显微摄影技术见实验2。（三）植物染色体组型分析技术由于国际上还没有一个植物染色体核型分析的共同标准，国内有关染色体的统计、测量、命名、图表格式等项工作，各人所采用的方法和标准也不尽相同，在染色体研究工作中，就有一个急需解决的问题，即核型分析的标准化问题。1984年8月，在辽宁兴城召开全国第一次全国植物染色体学术讨论会上，李懋学、陈瑞阳联名（1984）作了“关于植物核型分析的标准化问题”报告，经过与会代表的充分讨论，根据大多数代表的意见形成大家约定的标准，被同行所承认。1、核型分析的约定标准染色体的数目由于减数分裂价体难以保证准确，所以，仅除苔藓和蕨类因材料所限而用减数分裂细胞记数外，一般以体细胞染色体数目为准。统计的细胞数目应在30个以上。其中85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数目，即可认为是该植物种染色体数目。如果观察材料是混倍体，则应如实记录其染色体数目变异范围及各类细胞的数目及百分比。染色体的形态作为核型分析的染色体，一般以体细胞分裂中期的染色体作为基本形态，如果减数分裂粗线期的染色体分散良好，着丝粒清晰者，也可以用作核型分析。核型分析的细胞数目以5个以上的细胞为准，不仅要求有一定的数量，更要求有高质量的染色体图象