DNAExtraction法医学.ppt

DNAExtractionDNA提取,中山医学院法医物证教研室吕德坚,DNA提取的原因,DNA的分型需要DNA的直接参与反应过程DNA位于细胞内，细胞内可能含有抑制反应的蛋白或其他细胞成份DNA和蛋白质结合在一起不同的反应需要应用不同的DNA没有杂质纯DNA可使反应达到最佳法医学生物检材常含有抑制酶、PCR反应的物质,DNA提取方法,不同的检材用不同的方法不同的检材量可能使用不同方法和检材的细胞类型有关可根据肉眼、检查、显微镜下以及预试验来决定DNA的提取方法DNA提取的主要方法有机法（酚/氯仿法）Chelex法FTA纸法硅珠法、磁珠法碱裂解法,DNAEXTRACTION,ORGANICCHELEXFTAPAPEROTHERSNON-ORGANIC(6MNaCl)QUICK不溶的物质不被吸附而被去除。吸附后漂洗,将溶解的抑制剂洗去。当改变条件后(用洗脱液),DNA又可以从二氧化硅上解离出来;,硅(磁)珠粒吸附法,碱裂解法,碱性裂解法是指在强碱作用下,使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅速发生电离,从而快速破坏蛋白质的一级结构,正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用,所以,检材在强碱性条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞及核膜,使核酸酶变性及释放。而此时,的一级结构是相对完整的。,先用强碱(NaOH)破坏细胞结构再用中和液中和，使溶液维持在中性或偏碱性离心，上清可作PCR,差异消化提取法DifferentialExtraction,又称二步消化法用于精子和其它细胞的混合物检验，如强奸案的阴道拭子精子的细胞膜含有巯基构成二硫键，可抵抗SDS和PK的消化作用DTT可水解二硫键,DIFFERENTIALEXTRACTION,SEXUALASSAULTCASESMIXTURESPERMCELLSOTHERCELLSVAGINALEPITHELIALCELLSWHITEBLOODCELLSMALEEPITHELIALCELLS,DIFFERENTIALEXTRACTION,RUPTURENON-SPERMCELLSSDSPROTEINASEKPELLETSPERMCELLSREMOVEDNASUPERNATANTRUPTURESPERMCELLSSDSPROTEINASEKDTT,DIFFERENTIALEXTRACTION,DTTBREAKSDISULFIDEBONDSINSPERMMEMBRANEWILLNOTWORKFORVASECTOMIZEDORAZOOSPERMICMALESEPITHELIALFRACTIONWILLSHOWMIXYCHROMOSOMESPECIFICMARKERSCANBEUSED,实验的基本步骤,阴道拭子一步：先用SDS和PK消化上皮细胞，释放出上皮细胞的DNA，去除上皮细胞的DNA二步：再用DTT、SDS和PK消化精子，得到精子的DNA常分离不彻底一步会消化一部分精子的DNA,DNA的浓缩和纯化,乙醇沉淀法凝胶切割法低熔点琼脂糖法超滤法Centricon-100法Microcom-100法,低熔点琼脂糖法,Centricon-100法,Centricon浓缩器内有一层各向异性的膜，通过超滤作用可以对大分子溶液进行浓缩和脱盐。Centricon必须用有固定角度的转头离心，膜与离心力的方向有一个角度。在样品的浓缩过程中，样品溶液收集在有样品一面膜的边缘，整个过程的滤过率高而一致。如果用水平转子离心，样品在整个膜上面覆盖，会明显降低溶液的滤过。当溶液到达膜的边缘后，过滤作用停止，因此，转角的大小与最后所得的溶液体积有关。,Centricon浓缩器的组成,Centricon离心过滤器的使用,1.将样品管插入到滤液管上。2.加入DNA样品液到样品管(最大2mL)。3.将盖好的浓缩器放入离心机中。4.以1000g对CentriconYM-100进行离心。5.将离心过滤浓缩器从离心机上取下，然后从膜支撑基底上取下滤液管。按需要丢弃或保留滤液管。,6.将滞留管接在样品管管上，倒转过来，在离心机中以3001000g离心2min，将浓缩的样品转移入滞留管中。,7.从离心机上取下浓缩过滤器。取下滞留管，用盖盖住滞留管或滤液管，或者用滞留管盖滤液管以滞留管和滤液器可以一起存放。,Microcon-100法,Microcon离心过滤器可以对10500L的大分子溶液进行脱盐和浓缩Microcon-100需要一个可以使用1.5mL微离心管，转头角固定的可变速离心机。每个Microcon100离心过滤器含有两个带盖的管子，一个用收集滤液，一个用来回收滞留的样品。,Microcon-100的组成,Microcon离心过滤器的使用,1.将Microcon样品管插入滤液管中。2.将样品溶液加入到样品管中（最大0.5ml），封盖。3.把装好Microcon放入离心机中，盖子上的带指向转子的中央。4.用适当的转速和时间进行离心。,5.从离心机上取下Microcon，分离滤液管和样品管。6.将样品管的上端倒转向下插入一新的滞留液收集管中，1000g离心3min，转移浓缩的滞留液至收集管中。,7.从离心机上取下Microcon，分离样品管。将滤液和滞留液的管盖盖紧，保存产物。,DNA定量,凝胶产量法UV计法杂交法实时PCR法,凝胶产量法,杂交法,探针具有人种属特异性不受细菌DNA影响灵度非常高,DNAQUANTIFICATION,ESSENTIALFORPCRTESTINGTOOLITTLECAUSESALLELEDROPOUTORSTOCHASTICFLUCTUATIONTOOMUCHCAUSESOFFSCALEDATAEARLYMETHODSNOTVERYSENSITIVEORSPECIFICABSORBANCEAT260nmETHIDIUMBROMIDE,DNAQUANTIFICATION,SLOTBLOTQUANTIFICATIONSPECIFICFORHUMANORPRIMATEDNAD17Z1RADIOACTIVECOLORIMETRICCHEMILUMINESCENT,DNAQUANTIFICATION,CAPTUREGENOMICDNAONNYLONMEMBRANEADDD17Z1PROBEINTENSITYOFSAMPLECOMPAREDTOSTANDARDSSENSITIVETO150pgDNAor50copiesofgenomicDNA,DNAQUANTIFICATION,PICOGREENMICROTITERPLATEASSAYUSEDFORHIGHTHROUGHPUTMETHODS96WELLPLATESAUTOMATEDPROCEDURESENSITIVETO250pgDNA80SAMPLESANALYZEDIN30MINUTESNOTHUMANSPECIFIC(BACTERIACONTAMINATION),DNAQUANTIFICATION,PCRAMPLIFICATIONPICKY0.5TO1.0ngDNA1ngDNAroughlyequals333copies167CELLSEACHDIPLOIDCELLhasroughly6pgDNAEACHHAPLOIDCELLhasroughly3pgDNA,QuantiBlotHumanDNAQuantitationKit,SlotBloting,AluQuant,AluQuant采用二步温育定量人类DNA。第一步温育时发生焦磷酸化反应，它是DNA聚合反应的逆反应，一种称为READase的聚合酶催化双链DNA的3末端加上一个焦磷酸盐，导致3末端的碱基以dNTP的形式释放出来。dNTP在READase激酶的作用转化为ADP、ATP。第二步温育时，在ATP和荧光素酶(luciferase)的作用下，荧光素(luciferin)发光，测定光强度定量ATP的量。,AluQuant原理,RealTimePCR,所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。,一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。,为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的1