第三章 微生物细胞的破碎.ppt

第三章微生物细胞的破碎,分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步分离、纯化，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。,细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜，使胞内物质释放出来的方法。,细胞壁的破碎最为关键，这是因为：1）细胞壁是具有一定刚性和坚韧的物质，起到保护细胞的作用。2）细胞壁具有抗机械撞击的作用。,3.1细胞壁结构和化学组成,细胞壁的化学组成是非常复杂的，它不仅取决于微生物的类型，而且还取决于细胞的年龄和生长生理学。,1细菌,细菌的细胞壁经酸性水解后，可得到如下产物：(1)肽聚糖肽聚糖是细胞的主要成分，由下列化学物质组成：N-乙酰葡萄糖胺（NAG）；N-乙酰胞壁酸（NAM）；半乳糖胺(仅在某些细菌中)。(2)氨基酸(3)磷壁质仅在革兰氏阳性菌中存在。(4)糖(5)脂质脂质主要存在于革兰氏阴性菌中。,在革兰氏阳性细菌中，细胞壁的主要成分是肽聚糖，在壁中呈厚度为2080nm的均相层。,革兰氏阴性细菌的细胞壁较薄(1025nm)，但更加复杂，包括细胞质膜在内共有三层：一个刚性的肽聚糖内层和一个双层(中间是脂蛋白，外层是脂多糖)。,2真菌和酵母,酵母和真菌的细胞壁，在电子显微镜下观察呈纤丝状，约60nm厚，细胞壁的厚度取决于生长条件特别是碳源的类别。,细胞壁水解后的产物：糖及其氨基衍生物(主要是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和葡萄糖胺)葡聚糖是酵母细胞壁的主要成分(约30)；甘露糖(约30)也是重要的成分；几丁质虽然量较少(约12)，但是几乎在所有的酵母细胞中都存在。氨基酸主要是谷氨酸和天门冬氨酸，存在于蛋白质中，占细胞壁成分的57。脂质占细胞壁成分的113.5，其含量取决于菌种类型、培养基组成及其他一些因素。,3.2细胞破碎的方法,破碎细胞的方法很多，但选择何种方法则取决于破碎的目的和待破碎生物体的类型。,依据细胞的破碎是否外加作用力可分为机械法与非机械法两大类：,机械法中高压匀浆器和珠磨机不仅在实验室而且在工业上得到应用，超声波法和非机械法大多处在实验室应用阶段。,3.2.1机械方法,为了破碎微生物细胞，常常选择机械的方法，因为它们的处理量大，破碎速度较快。,采用机械方法，在大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏。,一固体剪切方法(珠磨法Beadmill),将细胞在珠磨机中破碎被认为是最有效的一种细胞物理破碎法。,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。,珠磨机的工作原理,破碎作用符合一级反应动力学，破碎的程度常用细胞破碎率()来表示：对于间歇操作：ln1/(1-R)=Kt（3-1）对于连续操作：1n1/(1-R)=K（3-2）其中=V/qv式中R-破碎率()；K-反应速率常数(1/s)；t-破碎时间(s)；-平均停留时间(s)；V-破碎室悬浮液体积(L)；qv-进料速率(L/s)。,反应速率常数K与许多操作参数有关，如珠体直径、珠体的装量、细胞浓度、料液性质、搅拌器转速与构型、操作温度等等。这些参数不仅影响破碎程度，也影响破碎所需的能量。,影响破碎率的因素：珠体的大小珠体的装量搅拌转速操作温度,延长研磨时间、增加珠体装量、提高搅拌转速和操作温度等可有效提高细胞破碎率，但能耗将大大增加。,二高压匀浆法(High-pressurehomogenization),高压匀浆法是大规模细胞破碎的常用方法，所用设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆阀组成。,在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个MPa，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度可达几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,高压匀浆法的原理是利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的或高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。,破碎的动力学方程可表示为：1n1/(1-R)=Ktnp(3-3)式中R-细胞破碎率；Kt-与温度等有关的破碎常数；n-悬浮液通过匀浆器的次数；p-操作压力；-与微生物种类有关的常数。,由破碎的动力学方程可知，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。一般说来，增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大。在工业生产中，通常采用的压力为5570MPa。,细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同种类的微生物细胞及同种细胞在不同的环境下，其细胞壁的结构不同。一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。,不宜采用高压匀浆法破碎的微生物细胞易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包涵体的基因工程菌（包涵体质地坚硬，易损伤匀浆阀）,高压匀浆法与珠磨法的比较1）高压匀浆法操作参数少，易于确定，适合于大规模操作；珠磨法操作参数多，一般凭经验估计。珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆需配备换热器进行级间冷却；,高压匀浆法与珠磨法的比较2）珠磨法破碎在适当条件下一次操作即可达到较高的破碎率，而高压匀浆往往需循环24次才行；3）珠磨机适合于各种微生物细胞的破碎，而高压匀浆不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌。,三超声破碎法(Ultrasonication),超声破碎也是应用较多的一种细胞破碎法，通常采用的超声破碎机的工作频率为1525kHz。,超声破碎机理-超声波引起空穴现象在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的震波。于是，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。,在用于细胞破碎的容器中，流体动力学按照完全混合方式，则蛋白质释放动力学遵循一级反应定律：1x=exp（-kt）(3-4)式中x为释放蛋白质的分率；k为蛋白质释放常数，min-1；t为超声波发射时间，min。,超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。,对不同菌种的发酵液，超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。,采用超声破碎法处理少量样品时操作简便，液量损失少，因而在实验室规模应用较为普遍。,超声破碎法的优点,超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。但在大规模操作中，声能传递和散热均比较困难。此外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活，因而有一定的局限性。,超声破碎法的缺点,四X-press法,X-press法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，具有适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但该法不适用于对冷冻敏感的生化物质。,3.2.2非机械法,许多非机械方法都适用于微生物细胞的破碎，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、热处理、化学法溶胞等，其中有些方法的应用是有限制的。,一酶溶法(Enzymaticlysis),酶溶法是利用酶反应分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。酶溶法可分为外加酶法和自溶法两种。,1外加酶法,常用的溶酶有溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,实例：对酵母细胞采用酶溶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内物质。,外加酶法主要用于实验室规模，如利用酶溶法可从细胞内不同位置选择性地释放目的产物和制取特殊的胞壁葡聚糖聚合物等。此外，酶溶法大量用来剥离细胞壁，将原生质体进行融合，这是细胞工程常用的方法。,选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,酶溶法的优点,1）溶酶价格高，限制了大规模应用；2）酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件；3）产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶，这是导致酶溶法胞内物质释放低的一个重要因素。,酶溶法的不足,2自溶法,自溶法是一种特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。控制一定条件，可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。,影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激活剂等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。,实例：对谷氨酸生产菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3，配成pHl0的缓冲液，再配3的细胞悬浮液，加热至70，保温搅拌20min，菌体即自溶。,1）对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性；2）自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。,自溶法的缺点,二化学渗透法(Chemicalpermeation),某些化学试剂，如有机溶剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性(渗透性)，从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。,1.表面活性物质,表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，能结合并溶解磷脂，因此其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。,2.EDTA螯合剂,EDTA螯合剂对革兰氏阴性菌细胞外层膜有破坏作用。革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴，细胞通透性增强。,3.有机溶剂,能分解细胞壁中的类脂。把相当于细胞量10的甲苯加到细胞悬浮液中，由于甲苯被吸收进细胞壁的类脂中，使胞壁膜溶胀，进而使细胞破碎，胞内物质被释放出来。除甲苯外，苯对类脂的分解作用也十分强，但由于较易挥发和较大的毒性而很少应用。,根据各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。,化学渗透法的优点,对产物释放具有一定选择性。控制条件可以有选择地释放出位于细胞内不同部位的产物。细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50。有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中，需设法分离除去。,化学渗透法的缺点,三渗透压法(Osmoticpressure),渗透压法将细胞放在高渗透压的介质中，达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破碎。于是，细胞内容物就释放出来。,细胞壁较脆弱的细胞细胞壁预先用酶处理在培养过程中加入某些抑制剂(如抗生素等)，使细胞壁有缺陷,渗透压法适用范围,四反复冻结-融化法,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。,由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,反复冻结-融化法只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，常需反复多次。此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,五干燥法,常用的使细胞干燥的方法有：气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。,通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就被抽提出来。,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在2530下的气流中吹干，然后用缓冲液抽提。,真空干燥多用于细菌。,冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。,干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质变性。提取不稳定生化物质时，常加某些试剂进行保护，如半胱氨酸、巯基乙醇和亚硫酸钠等还原剂。,若提取产物在细胞质内，需用机械破碎法；若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法；若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放率不变。,选择破碎方法的一般原则,细胞破碎方法的研究方向,多种破碎方法相结合；与下游过程相结合，必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净；与上游过程相结合，细胞的培养过程及其环境条件对细胞的结构及破碎难易有很大影响。,3.3破碎率的评价,破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：Y()(N0-N)/N0100N0：原始细胞数量N：经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。,直接计数法直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。,(2)间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(可溶性蛋白、酶等)。破碎率可通过被释放出来化合物的量R与所有细胞的理论最大释放量Rm之比进行计算。,间接计数法最常用的细胞内含物是蛋白质，特别是酶活性释放到基质中，是破碎程度很好的指示参数。,3.4包涵体的分离和蛋白质复性,很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素-6、人-干扰素等）不仅不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包涵体。,包涵体颗粒直径约0.13.0m，随表达产物而异。较大的包涵体可在相差显微镜下观察到，呈现深色的点，所以包涵体又称光折射体。,包涵体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。,一包涵体的形成,分