ISO16072土壤微生物呼吸的试验室测定方法-中国科学院南京土壤

ICS13.080.01B10中华人民共和国国家标准GB/TXXXXX2011/ ISO 16072：2002土壤微生物呼吸的实验室测定方法Laboratory methods for determination of microbial soil respiration(ISO 16072:2002，IDT)（本稿完成日期：2014年8月）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施GB/T XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13 术语和定义14 步骤24.1基本条件24.2选择测定方法25测定方法35.1压力补偿系统静态培养O2消耗量的测定法35.2静态系统中CO2释放量的测定滴定法45.3静态系统中CO2释放量的测定库仑定量法65.4流动系统中CO2释放量的测定红外气体分析法75.5流动和静态系统中CO2释放量的测定气相色谱法85.6静态系统中O2消耗量的测定压力法13参考文献17前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T 20000.2-2009规则起草。本标准使用翻译法等同采用国际标准 ISO 16072:2002土壤质量土壤微生物呼吸的实验室测定方法。为了便于使用，本标准做了下列编辑性修改：将标准名称改为土壤微生物呼吸的实验室测定方法本标准由全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC404）提出并归口。本标准起草单位：中国科学院南京土壤研究所、中国科学院南京地理与湖泊研究所、江苏省标准化研究院。本标准主要起草人：林先贵、陈瑞蕊、吴庆龙、褚海燕、陈美军、刘颖。土壤微生物呼吸的实验室测定方法1 范围本标准规定了好氧、不饱和土壤中土壤微生物呼吸的测定方法，此方法适用于添加底物（底物诱导呼吸）或不加底物（基础呼吸）条件下氧气消耗量或二氧化碳释放量的测定。本标准适用于下述目的土壤呼吸的测定： 确定土壤微生物活性（见参考文献3）； 判定添加物（养分、污染物、土壤改良剂等）对土壤微生物代谢强度的影响； 确定土壤微生物生物量（见参考文献4）； 确定代谢熵（qCO2）。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO 10381-6:1993 土壤质量-采样-第6部分实验室测定好氧微生物过程用土壤的采集、处理及贮存指南（Soil quality-Sampling-Part6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory）ISO 11274:1998 土壤质量-持水特征的测定-实验室方法（Soil quality-Determination of the water-retention characteristic-Laboratory methods）ISO 11465:1993 土壤质量-质量基土壤干物质和含水量测定重力测定法（Soil quality-Determination of dry matter and water content on a mass basis-gravimetric method）3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 基础呼吸basal respiration不添加营养时土壤微生物的呼吸。3.2 底物诱导呼吸substrate-induced respiration（SIR）添加底物营养后土壤微生物的呼吸。注：如添加葡萄糖作为营养。3.3 微生物活性microbial activity微生物的代谢强度。注：可以定量表示，如通过氧气消耗量或二氧化碳释放量计算。3.4 代谢熵（qCO2）metabolic quotient微生物的平均代谢活性，可以通过基础呼吸与微生物生物量的比值计算。注：代谢熵一般以每克微生物生物量碳每小时所排放CO2的碳的毫克数来表示。3.5 CO2形成速率（O2消耗速率）rate of CO2 formation O2 consumptionRCO2 (RO2)：单位质量土壤单位时间内释放CO2的量（或所消耗O2的量）。注1：土壤呼吸速率通常用CO2释放量或O2消耗量来测定。注2：单位通常表示为mg CO2/(gh)。3.6微生物生物量microbial biomass土壤中活体微生物细胞生物量注：通过微生物细胞中碳或氮的含量来计算。4步骤4.1 基本条件4.1.1土壤采样与储存土壤的采样、储存和预处理参照ISO10381-6中的规定，与选择的测定过程及基础呼吸参数无关。4.1.2测定和培养条件土壤呼吸受到土壤含水量和温度的影响，测试报告中应包含土壤含水量和温度参数。当负压大于0.03 MPa时，土壤呼吸将明显减弱。待测土壤的最佳含水量，孔隙水压为0.01 0.03 MPa（测定精确度为5%，与ISO11274保持一致），或者含水量为最大田间持水量的40%至60%。恒温培养一般采用20 30，也可使用其它温度。在后续方法描述中，有培养温度及培养时间的举例。土壤微生物生物量的测定推荐采用22，与生物量的校准温度保持一致。比较土壤呼吸时土壤样品应具有相同的水分状况（以孔隙水压或者占最大田间持水量的百分比表示）。4.2 选择测定方法每种测定方法都有优缺点，而O2消耗量法和CO2排放量法获得的结果并不完全一致，因此采用哪种方法需要认真考虑。采用条例5中的某一种方法。CO2释放量法不能区分微生物代谢释放的CO2和其它非生物因素产生的CO2。对于碱性土壤或者是有机质含量高的土壤，非生物因素释放的CO2量比较大，推荐采用O2消耗量法。注：方法的优缺点将在各个方法中描述。5 测定方法5.1压力补偿系统静态培养O2消耗量的测定法5.1.1原理测定封闭系统中土壤样品培养过程中O2的消耗量，系统中O2通过电化学系统自动补充，释放出的CO2被系统中的Ca(OH)2吸收。A反应器1 土壤样品4电解液B氧气产生器 2 CO2吸收剂5电极C压力指示器3压力传感器 6记录仪图1 O2消耗量的测定5.1.2设备仪器的详细描述见参考文献4，基本特征如下：测定系统（见图1）是一个控温的水浴设备，由反应器（A）、O2产生器（B）和压力指示器（C）三个单元组成。A、B、C三部分组成一个封闭系统，各部分之间由管子相连。在这个系统中，测定结果不会受气压波动影响。释放的CO2被Ca(OH)2吸收（2）。呼吸作用消耗掉的O2会产生一个负压，产生的负压将传感到压力指示器（C）。这将驱动系统自动补充O2并在记录仪上产生测定曲线（6）。O2的消耗量在曲线上可以直接显示（mg）。5.1.3实验方法取50 100 g过筛（2 mm）的新鲜土壤样品用于测定。因为系统平衡需要一定时间，所以起初2小时不需要测定O2的消耗量。5.2 静态系统中CO2释放量的测定滴定法5.2.1原理在封闭器皿中培养土壤，释放出的CO2由NaOH吸收。根据反滴定未中和的NaOH，计算消耗掉的NaOH，然后计算出CO2的释放量。该方法适用于大量样品的测定。5.2.2试剂5.2.2.1 去CO2水蒸馏水煮沸，冷却后储存于带盖子的长颈瓶中，瓶盖中装有Ca(OH)2可以去除CO2。5.2.2.2 氢氧化纳（NaOH）溶液，c = 0.05 mol/L5.2.2.3 盐酸（HCl）溶液, c = 0.1 mol/LNaOH（5.2.2.2）和HCl（5.2.2.3）溶液的浓度应确保中和CO2的NaOH量低于总量的20%。过高的中和量会使结果不稳定。如果使用其它浓度，计算式（1）要相应的修改。5.2.2.4 氯化钡（BaCl2）溶液，c = 0.5 mol/L将10.4 g BaCl2溶于100 mL去CO2蒸馏水中。5.2.2.5 指示剂将0.1 g 酚酞溶解于100 mL 60%酒精溶液中（乙醇体积分数）。5.2.3设备5.2.3.1 带旋转盖的广口瓶（250 mL）或带橡胶塞的贮存瓶（1 L）5.2.3.2 离心管或具边反应试管（例如聚丙烯材质，外径为29 mm，长度为120 mm）。离心管上需钻若干小孔以方便气体交换。也可用有微孔的尼龙袋悬挂于广口瓶的瓶颈上。5.2.4步骤称取20 25 g新鲜土壤样品到离心管（5.2.3.2）中，将离心管悬置于广口瓶（5.2.3.1）中（图2），广口瓶底部预先装有20 mL的NaOH溶液（5.2.2.2）。广口瓶密封后，于恒温（如22 1）培养室内培养24 h。在密闭瓶口前，要用空气（低CO2浓度）置换瓶内气体。然后移出试管，加入2 mL BaCl2 溶液（5.2.2.4），将CO2以BaCO3的形式沉淀。加入3 4滴指示剂（5.2.2.5），用HCl（5.2.2.3）滴定剩余的NaOH（5.2.2.2）。测定至少重复三次，同时设置空白对照（即不装土壤样品的广口瓶）。如果需要长期测定土壤呼吸（3天），应每3天更换一次广口瓶中的NaOH溶液，每3天调节一次土壤含水量。1广口瓶（250 mL） 6 气体交换口2旋转盖 7 土壤样品3 倾倒圈 8 氢氧化钠溶液4 密闭垫 9 塑料线5 悬置的离心管 10 有微孔的尼龙袋图2 测定土壤呼吸用的广口瓶培养装置培养装置也可采用带橡胶塞、盖子和2个通用夹子的的贮存瓶（1 L）。称取土壤样品（200 g）置于贮存瓶底部的结晶盘上。将NaOH放在一个烧杯中。在贮存瓶底部，放4 mL去CO2水，以保持湿度。注：实验室测定基础呼吸时，在第一个小时经常观察到CO2释放量升高。这种升高可能与土壤样品准备过程中移动或者混和土壤颗粒时增加营养有关，也可能与短期内气体CO2与溶液中CO2的平衡相关。获得稳定基础呼吸状态的培养时间决定于土壤样品中易获得的碳化合物的初始含量。所有测定CO2释放量的方法都存在这一现象。5.2.5结果计算计算CO2释放量的公式：（1）式中：RCO2CO2的产生速率mg CO2/(gh)；Vb对照中消耗的HCl平均量（mL）；Vp样品消耗的HCl平均量（mL）；msm新鲜土壤的质量（g）；wsd新鲜土壤换算成干土的转换系数，即土壤干重占湿重的比率；2.2系数（1 mL 0.1 mol/ L HCl相当于2.2 mg CO2）mg/(mLday)；24 将天转化为小时的系数（h/day）。注：土壤干重占湿重的比率等于干重百分比。上式只适用于特定浓度的试剂（0.05 mol/LNaOH，0.1 mol/L HCl）5.3 静态系统中CO2释放量的测定库仑定量法5.3.1原理土壤样品在恒温容器中培养（3个重复），产生的CO2被NaOH吸收，反应式如下：2 NaOH + CO2 Na2CO3 + H2OOH- 被CO32-取代，这两种离子具有不同的电导率，仪器能记录电导率的变化。仪器能检测到CO2浓度0.0001%的变化（体积分数）。通过该仪器，可以检测到土壤的基础呼吸及加入葡萄糖后诱导的土壤呼吸。土壤样品质量及温度要求应根据需要来确定。更多细节可参考文献6和文献8。5.3.2测定装置图3是简易测定装置的示意图。1 装有土壤样品的容器 2 电导率传感器 3 铂电极图3 库仑定量法测定土壤呼吸的仪器装置5.4 流动系统中CO2释放量的测定红外气体分析法5.4.1原理待测样品应与空气充分混合。培养期间可通过配备流量计的红外气体分析仪测定土壤中排放的CO2。该方法适用于测定土壤微生物生物量，测定时温度宜为22。若采用其它温度，计算时应乘以一个校正系数。1土壤样品容器 5 三通阀 9 流量调整和流量表2 空气入口 6 转向装置 10 红外CO2分析仪3 气泵 7 关闭阀 11 控制器4 加湿器 8 参比空气 12 控制和评价设备图4 测定土壤呼吸的红外气体分析系统5.4.2试剂5.4.2.1 CO2校准气体（350 L CO2/L和400 L CO2/L的空气）5.4.3仪器常规实验设备及红外气体分析仪（图4），置于恒温（如22 1）室内。5.4.4步骤根据需要，称取10 200 g新鲜土壤样品到样品管中（3个重复）。将土壤样品填满样品管（最好使用多孔渗水的聚亚安酯泡沫塞），如图5所示。为了控制仪器的基准值，至少应有两个空白样。将样品管与测试设备连接后，启动空气泵，调节每个管道的气流到合适值。正常情况下，测定值可以被分析软件自动记录。红外气体分析仪每隔一到两周需要校准气体进行重新校准。土壤样品周围空气的流动可以减少土壤中碳酸盐平衡的干扰（尤其是石灰质土壤），所以降低了非生物因素释放CO2引起错误的风险。使用上述仪器时土壤样品重量（10 100 g）与CO2释放量应存在良好的线性关系。与采用去CO2空气测定CO2释放量的流动系统相比，此系统中未发现微生物柠檬酸循环的抑制。1 土壤样品 2 多孔渗水的聚亚安酯泡沫塞 3 橡皮塞 4 丙烯酸玻璃圆柱体图5 红外气体分析仪测定土壤呼吸的样品管5.4.5计算与结果红外气体分析仪测定CO2释放量采用差异反馈方式。CO2的产生速率（每克土壤每小时产生CO2的毫克数）可以通过软件计算，计算公式基于气体流速（mL/ min）和土壤样品的干重（g）。 （2）式中：RCO2CO2的产生速率mg CO2/(gh)；s土壤样品管中CO2的体积分数（L CO2/L）；e空样品管中CO2的体积分数（L CO2/L）；qg读出的气流速度(L/h)；0.00183 将CO2体积（L）转化为质量（mg）的转换系数（mg/L），在22、压力为101.3 kPa条件下CO2每摩尔体积为24.057 L，；msm新鲜土壤的重量（g）；wsd新鲜土壤换算成干土的转换系数，即土壤干重占湿重的比率。5.5 流动和静态系统中CO2释放量的测定气相色谱法5.5.1原理新鲜土壤样品置于恒温（如22 1）培养箱或培养室里黑暗培养。样品要置于空气或去除CO2的合成空气中。培养阶段土壤样品释放的CO2可以通过配备流量计的气相色谱仪（火焰离子化检测器或热导检测器）测定。5.5.2试剂5.5.2.1 如果是环境气体，CO2校准气体浓度为300 L/L 500L/L5.5.2.2 如果是合成气体，CO2校准气体浓度为20L/L 200L/L5.5.3仪器5.5.3.1 恒温培养箱或培养室5.5.3.2 气体流量计5.5.3.3气体压力计5.5.3.4 检测器为火焰离子化检测器或热导检测器的气相色谱仪注：热导检测器经常用于检测除CO2外的其它气体。火焰离子化检测器不能做到这一点。然而，如果没有热导检测器，旧的气相色谱仪也可以升级。就检测CO2而言，火焰离子化检测器与热导检测器功效完全一样。5.5.3.5 用于数据计算和系统控制的计算机5.5.4步骤5.5.4.1 总则样品可以通过流动系统（图6）进行连续培养也可以通过注入气体的方式进行不连续培养。5.5.4.2 流动系统方法根据需要，称取10 200 g新鲜土壤样品到样品管中（三个重复），填满样品管（最好使用多孔渗水的聚亚安酯泡沫塞），如图5所示。为了控制仪器的背景值，至少两个空白样。将样品管与测定设备连接后，启动空气泵，调节每个管道的气流到合适值。分析软件可以自动记录测定值。气体流量控制在80 mL/min到300 mL/min。分析系统每隔一到两个星期需要用标准气体校准。在测定浓度范围内，用三个浓度验证检测仪器的线性关系。5.5.4.3 注射法在图7气体注射方法中，称取2 4 g（三个重复）的新鲜土壤样品（含水量为最大持水量的40% 60%，或负压为0.01 Mpa 0.03 MPa）到安瓿瓶中。用洁净的空气清洁一个密封的玻璃注射器，然后将安瓿瓶放在注射器底部（图7）。用注射器活塞将多余的气体排出，注射2 mL气体到气相色谱仪中（检测初始值），然后将塞子调整到16 mL的地方，将针管插入橡皮塞中封闭注射器。在培养过程中，使注射器一直处于垂直状态，培养期间，保持压力和温度恒定。到达一定培养时间后（大约20 h，培养温度根据实验需要设定），移去橡皮塞，再注射2 mL气体到气相色谱仪中（检测终值）。将装有土壤的安瓿瓶取出，擦净并在105干燥称重。也可以用血清瓶代替。装有10 g土壤的血清瓶（体积116 mL）用橡胶膜密闭（图8）。培养方法同前。培养开始时及培养20 24 h后，分别用注射器取气体，注射到气相色谱中，气相色谱仪与热导检测器相连（5.5.5.2）。CO2释放速率的计算公式参考5.5.6.1和5.5.6.2。1土壤样品管 5 三通阀 9 积分器2 入气口 6流量表 10控制和数据处理设备3 空气加湿气 7 压力表4 培养器 8 气相色谱图6 用气相色谱仪-流式分析仪测定土壤呼吸的示意图1 土壤样品 2 样品瓶 3 橡皮塞 4 总体积（16mL）图7 注射法测定土壤呼吸的示意图1 血清瓶 2 橡皮塞 3 密闭的注射器 4 土壤样品图8 气相色谱法测定土壤呼吸的示意图5.5.5 检测5.5.5.1原理根据使用说明书，用火焰离子检测器（FID）或热导检测器（TCD）检测CO2。如果没有使用说明书，可以根据5.5.5.1或5.5.5.2步骤来做。5.5.5.2 采用火焰离子检测器的气相色谱仪检测CO2，当加入H2和CO2反应后，将CO2转化为CH4，火焰离子检测器（FID）可以检测到CH4，检测温度至少为350。同时H2也是火焰离子检测器的燃气。毛细管柱或填充柱可以用于分离。直径小于0.53 mm的毛细管柱由于流量有限，不适用该系统。测定温度为恒温80。若手动测样，可用密闭注射器直接注射气体样品。如在线检测，则可以用自动进样仪。5.5.5.3 采用热导检测器（TCD）的气相色谱仪需要配备热导检测器的气相色谱仪，检测温度为150。用填充柱进行分离。测定40恒温进行。在线监测或单样品监测都可以。样品分析系统参考5.5.5.1中描述。5.5.6 结果计算（注射器法）5.5.6.1 测定体积计算玻璃安瓿瓶的体积（Vamp）、土壤样品干重体积（Vsd）、水的体积（Vw）参照如下公式：（3）（4）（5）式中：Vamp安瓿瓶的体积（mL）；mamp安瓿瓶的重量（g）；quartz石英的密度（g/mL）=2.65 g/mL；Vsd烘干土壤的体积（mL）；msd烘干土壤的重量（g）；sd烘干土壤的密度（g/mL），矿质土壤密度为2.65 g/mL,有机质土壤密度为1.2 g/mL；Vw水的体积（mL）；mw水的重量（g）；w水的特定密度（1 g/mL）。5.5.6.2 CO2释放量的计算（6）（7）（8）（9）（10）式中：RCO2CO2的产生速率mg CO2/(gh)；CO2富集CO2所占比例（L /L）；1CO2所占初始比例（L /L）；2CO2所占最终比例（L /L）；VCO2富集CO2的体积（mL）；V0标准条件下（1013.25 hPa, 273K），富集CO2的体积（mL）；Vexp在实验条件下，富集CO2的体积（mL）；Pexp实验条件下的压强（hectopascals）；Vsyr注射器体积（mL）；44每摩尔CO2的质量（g/mol）；22 在标准条件下每摩尔CO2的体积（L/mol）；t培养时间（h）；msd烘干土壤样品的质量（g）；Vsd烘干土壤样品的体积（mL）；Vamp安瓿瓶的体积（mL）；Vw水的体积（mL）5.6静态系统中O2消耗量的测定压力法5.6.1 原理土壤呼吸过程中消耗O2的同时产生CO2。在一个封闭系统中发生上述过程时，如果CO2被吸收剂吸收，那么消耗掉的O2将使系统中的气压降低。因为是封闭系统，系统内的气压降低与外部无关，气压的改变量与O2消耗量成比例。5.6.2 仪器（图9和10）5.6.2.1 反应容器（例如：ISO 4796中的广口瓶，或容量为0.5 1 l的贮存瓶）5.6.2.2 配有气压计的广口瓶（误差率小于 0.5%）5.6.2.3 放CO2吸收剂的容器5.6.2.4 测定气压的仪器（气压计）5.6.2.5恒温培养箱5.6.2.6天平5.6.2.7干燥器5.6.3试剂5.6.3.1 CO2吸收剂：根据需要，选择Ca(OH)2，KOH或NaOH溶液。若测定间隔小于1天（见图9），不宜使用Ca(OH)2。如果是贮存瓶，宜使用KOH或NaOH溶液。5.6.3.2 去离子水1 气压计 2 放吸收剂的容器 3 适配器 4 反应器 5 土壤样品图9 气压法测定土壤呼吸的测试示意图 (高压瓶)5.6.4步骤5.6.4.1 土壤样品和仪器的准备5.6.4.1.1 根据ISO 11465，测定土壤干重占土壤湿重的比例。5.6.4.1.2 调整土壤样品的水分含量（如调到最大持水量的50%）。可以通过添加去离子水（5.6.3.2）或在19 22空气中干燥来实现。5.6.4.1.3 测定已调节含水量的土壤样品的体积将100 ml的去离子水放在量筒里（200 mL），然后将100 g已调节含水量的土壤倒入水中轻轻搅拌。量筒中土壤替代水的体积就是土壤的体积（Vsm）。下述数据如果未知，则需要测定： 封闭容器总体积 吸收剂容器体积（Vav） 吸收剂体积（Vam）5.6.4.2 测定将土壤样品（如50 300 g）轻轻的放入反应器皿中。加入足够的CO2吸收剂到吸收容器中。通过连接气压计来封闭反应器，在恒温黑暗条件下培养一段时间。前3个小时产生的压力变化可能由温度平衡引起，通常不考虑。但如果设备可以自动调温，则不存在此问题。1 气压计 2 盖子 3 悬浮器 4 NaOH、KOH或者Ca(OH)2溶剂 5反应器 6 土壤样品图10 气压法测定土壤呼吸的示意图（广口瓶）5.6.5 数据运算5.6.5.1 自由气体体积计算自由气体体积计算公式：（11）式中：Vfg自由气体体积（L）；Vtot测定器皿的总体积，不包括土壤、装吸收剂的器皿及吸收剂体积（L）；Vav装吸收剂器皿的体积（L）；Vam吸收剂的体积（L）；Vsm潮湿土壤的体积（L）。5.6.5.2 计算土壤的干重土壤干重计算公式（12）式中：msd土壤干重（kg）msm土壤湿重（kg）wsd土壤干重占湿重的比例5.6.5.3 计算O2消耗率O2消耗率的计算公式：RO2 = 32000 Vfg p / (t RTmsd) （13）式中：RO2O2的消耗速率mg O2/(gh)