医学检验本科生毕业论文

本科毕业论文 题 目： NIX蛋白诱导PC12细胞自噬及其分子 机制的初步研究 姓 名： 刘海波 学 号： 2010223243 系 别： 检验医学院 年 级： 2010级 专 业： 医学检验 指导老师： 刘彤副主任检验师 实习单位： 成都军区总医院 目 录中文摘要3英文摘要3前 言41 材料与方法41.1试剂，材料和仪器41.1.1试剂细胞培养试剂质粒转染试剂 Western bloting检测试剂免疫荧光技术检测试剂51.1.2材料61.1.3仪器61.2 研究对象61.3 实验方法61.3.1 PC12细胞的培养61.3.2 pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒瞬时转染71.3.3 Western blot检测质粒转染后相关蛋白表达71.3.4 免疫荧光技术检测质粒转染后细胞中的自噬水平71.3.5数据统计分析82 结果82.1 Western blot检测各组细胞中FLAG-NIX融合蛋白的表达情况92.2 Western blot检测各组细胞中LC3-I和LC3-II的表达情况102.3 Western blot检测各组细胞中Beclin-1的表达情况112.4 Western blot检测各组细胞中Uchl-1的表达情况122.5 Western blot检测各组细胞中Hsc70的表达情况132.6荧光显微镜观察各组细胞中EGFP-LC3的表达情况143 讨论15结论15参考文献15开题报告17致谢22NIX蛋白诱导PC12细胞自噬及其分子机制的初步研究摘 要目的：研究NIX蛋白对PC12细胞自噬的诱导作用及其分子机制。方法：使用0.5、1、2、3g浓度梯度的pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染PC12细胞，Western blot检测不同浓度梯度下各组PC12细胞中FLAG -NIX、LC3-I、LC3-II、Beclin-1、Uchl1及Hsc70等蛋白的表达情况。同时，使用0.5、1、2、3g浓度梯度的pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染EGFP-LC3稳转PC12细胞，利用荧光显微镜观察各组细胞中EGFP-LC3重组蛋白表达情况。结果：随着pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染浓度的增加，FLAG-NIX融合蛋白、LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1蛋白呈梯度增长，Uchl1蛋白呈梯度减少，Hsc70蛋白没有明显变化，而EGFP-LC3重组蛋白的表达与LC3-II/LC3-I比值相一致。结论：NIX蛋白可诱导PC12细胞自噬，其分子机制可能与LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1蛋白和Uchl1蛋白有关。关键词：NIX；自噬；PC12细胞；过表达Preliminary Study on NIX induced PC12 cell autophagy and the molecular mechanismsAbstractObjective：To Study on NIX induced PC12 cell autophagy and the molecular mechanisms. Methods：Using 0.5, 1, 2, and 3 g concentration gradient pcDNA3.1 (+)-N2-FLAG-NIX plasmid transfected with PC12 cells, Western blot detection of different concentration gradients in PC12 cells for each group, such as LC3-I, LC3-II, Beclin-1, Uchl1 and Hsc70 protein expression. At the same time, using 0.5, 1, 2, and 3 g concentration gradient pcDNA3.1 (+) EGFP-LC3 steady go-N2-FLAG-NIX plasmid transfection of PC12 cells, using fluorescence microscopy EGFP-LC3 recombinant protein expression in cells of each group. Results：As pcDNA3.1 (+) transfected with increased concentrations of-N2-FLAG-NIX plasmid, FLAG-NIX fusion protein, gradient ratio, Beclin-1, LC3-II/LC3-I protein growth, Uchl1 gradient reduction, Hsc70 protein recorded virtually no change, and EGFP-LC3 recombinant protein expression consistent with the ratio LC3-II/LC3-I.Conclusion: NIX proteins can induce PC12 cells autophagy, and the molecular mechanism may be associated with LC3-II/LC3-I ratio, Beclin 1 protein and Uchl1 protein.KeywordsNIX; autophagy; PC12 cells; over-expression前 言自噬(autophagy)是指细胞在外界环境因素的影响下，细胞对其受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入其内的病原体进行降解的生物学过程1。其有广义和狭义之分，广义上的自噬可以分为三种形式即大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chapeon-mediated autophagy)，狭义上的自噬即大自噬2。从目前的研究结果来看，细胞自噬的调节涉及众多的基因表达和信号转导，主要的途径是在溶酶体体内进行的一种降解过程。细胞自噬所产生的物质和能量，还可以重新参与细胞的生命活动。因此，细胞自噬过程可以使机体在十分严峻的生存条件下通过“降解自我、提供营养成分和能量”得以生存，同时也是清除侵入人体内病原体的主要机制。如果细胞自噬的水平和调节出现紊乱，则会导致一系列的疾病状态。自噬过程是一个复杂而连续的过程，但是为了描述方便，科学家将自噬过程分为四个不同的阶段3，第一阶段：在饥饿或者某些激素等因素的刺激下，在待降解物周围缓慢形成双层膜杯状的分隔膜。第二阶段：分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕隔离形成自噬体。第三阶段：自噬体形成之后将其包裹物质运输至溶酶体内并与溶酶体融合成为自噬溶酶体，这一运输过程是依靠细胞骨架微管网络系统的传输实现的。第四阶段：自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体内的水解酶降解，它首先经历囊泡酸化，待达到所需PH值之后经多种蛋白酶的消化作用使囊内物质溶解，降解产物在细胞内可以循环利用。起初科学家们在研究腺病毒E1B(19 kDa)关联蛋白时发现了NIX (NIP3-Like protein X)蛋白又称BNIP3L蛋白。后来的研究表明，NIX是 Bcl-2 家族中的BH3-only 亚家族成员4，由人胎盘cDNA 文库中克隆而来，与BNIP3 存在56%的同源性。随着对NIX的深入研究，研究者们发现NIX 与BNIP3类似其编码产物均含有Bcl-2 家族特征性的BH3 结构域和羧基末端跨膜结构域(TM)，能与Bcl-2 、Bcl-X1、E1B19K 等蛋白相互作用，促使细胞色素C释放，进一步诱导细胞凋亡5-6。NIX能与Bcl-2 相互作用形成二聚体。但NIX促细胞凋亡过程与其他Bcl-2 家族成员促细胞凋亡过程相比之下又有明显不同研究者们发现NIX引起细胞凋亡是由于NIX与线粒体膜结合后能诱发线粒膜通透性孔开放，线粒体内膜跨膜电位降低，线粒体膜去极化，活性氧增加7从而导致细胞凋亡。NIX 引起的细胞凋亡发生时间一般在缺氧72 h 后发生,较典型性的细胞凋亡晚， 它引起浆膜和线粒体的损伤，可导致染色体DNA 断裂成大分子片段，呈现非典型性细胞凋亡的特点8。此外，大量的研究发现，NIX参与了多种细胞线粒体的自噬过程9-11，并且在细胞自噬、心脏疾病以及肿瘤的致病过程中发挥了重要的调控作用12-14。尽管大量的研究已经证明，与线粒体自噬相关的蛋白有Atg,Uth1,Aup1,NIX, PINK1和Parkin等蛋白。在不同的细胞模型中，它们都能够促进细胞自噬发生，人们对大多数蛋白的作用机制有一定的了解，但是对NIX具体的分子作用机制的认识尚不清楚。因此，本实验以PC12细胞为模型，使用pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染pc12细胞，采用Western blot和免疫荧光技术，通过NIX对PC12细胞自噬线的诱导作用，寻求其可能的分子机制。1 材料与方法1.1试剂，材料和仪器1.1.1试剂细胞培养试剂DMEM完全培养基（含10%热灭活胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml）：DMEM完全培养基购自GIBCO公司。10%热灭活胎牛血清(例如：配置100ml):吸取10ml 热灭活胎牛血清，加入DMEM培养基定容至100ml。胎牛血清：购自GIBCO公司。青、链霉素溶液：ddH2O预先121高压灭菌20分钟。青霉素：80万单位/瓶，使用注射器加4ml灭菌的ddH2O。链霉素：100万单位/瓶，加入5ml灭菌ddH2O，即配置成每毫升各为20万单位。用小管分装放在20冰箱保存。试验时，青、链霉素的终浓度为100单位/ml。0.25%胰蛋白酶溶液：准确称取胰蛋白酶粉剂0.25g溶入100ml D-hanks液中。均匀搅拌后，置于4冰箱过夜。在超净台内用注射滤器（0.45m和0.22m双层微孔滤膜）超滤除菌。然后分装在1.5ml EP管中，置于-20冰箱保存备用。D-hanks液（pH7.2-7.4）：称取NaCl 8g, KCl 0.4g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, NaHPO4H2O 0.06g，加入ddH2O混匀至1000ml。质粒转染试剂pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒：由四川大学华西附二院姜长安教授惠赠。MegaTran 1.0转染试剂盒：购自OriGene公司。Opti-MEMI优化培养基：购自GIBCO。DMEM完全培养基：购自GIBCO公司。 Western bloting检测试剂D-hanks液：（同上）。0.25%胰蛋白酶：（同上）。Ripa裂解液：购自碧云天生物公司。BCA蛋白定量试剂盒：购自北京康为世纪生物科技有限公司。SDS-PAGE电泳胶：15%分离胶：纯化H2O 1.1ml, 30%丙烯酰胺 2.5ml, 1.5M TrisHCl（pH8.8） 1.3ml, 10%SDS 0.05ml, 10%过硫酸铵 0.05ml, TEMED 0.002ml, 将以上物质混匀，TEMED最后添加。5%浓缩胶：纯化H2O 1.4ml, 30%丙烯酰胺 0.33ml, 1.5M TrisHCl（pH6.8） 0.25ml, 10%SDS 0.02ml, 10%过硫酸铵 0.02ml, TEMED 0.002ml, 将上述物质混匀，TEMED最后添加。电泳buffer：称取Tris（MW121.14） 3.03g, 甘氨酸（MW75.07） 18.77g, SDS 1g, 加蒸馏水溶解，定容至1000ml. 室温保存，可重复使用3-5次。转移buffer： Tris（MW121.14） 5.8g, 甘氨酸（MW75.07） 2.9g, SDS 0.37g, 甲醇200ml用蒸馏水定容至1000ml, 室温保存，可重复使用3-5次。Anti-NIX: 购自CST公司。Anti-FLAG: 购自ProteinTech Group公司。Anti -LC3B: 购自CST公司。Anti-Beclin-1: 购自CST公司。Anti-Uchl-1: 购自CST公司。Anti-Hsc70: 购自CST公司。Anti-actin: 购自成都正能生物技术有限责任公司。TBST缓冲液：先取部分体积TBS，加入20% Tween 20：2.36ml, 然后继续加入TBS定容至1000ml。TBS缓冲液：称取NaCl 8.8g, 量取1M TrisHCl(pH7.5) 10ml, 加入蒸馏水，定容至1000ml。辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔或鼠二抗：购自CST公司。ECL化学发光试剂：购自Millipore公司。1%脱脂奶粉：称取1g脱脂奶粉，加入100ml的RO水，混合均匀，于4度冰箱保存，需尽快用完。免疫荧光技术检测试剂多聚赖氨酸：称取多聚赖氨酸4g, 充分溶于1000ml去离子水中，4保存。MegaTran 1.0转染试剂盒：购自OriGene公司。pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒：由四川大学华西附二院姜长安教授惠赠。Opti-MEMI优化培养基：购自GIBCO公司。DMEM完全培养基：购自GIBCO公司。PBS（0.01M）：称取NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, 将以上粉剂溶于1000ml纯水中，搅拌均匀即可。封闭液（2%胎羊血清）：吸取0.8ml胎羊血清，加入D-hanks液定容至40ml。Anti-Tom20：购自Santa Cruz公司。Anti-LC3B：购自CST公司。555荧光标记二抗(1:1000)：购自碧云天生物公司。核染料DAPI(1:1000)：购自碧云天生物公司。1.1.2 材料酒精棉球、玻璃棒、一次性手套、牛皮纸、石棉绳、烧杯（100ml、1000ml）、镊子、铝饭盒、枪头（10l、200l、1000l）、移液枪、三角烧瓶（250ml、100ml）、1.5mlEP管（高压灭菌）、试管（20ml）、平板（20ml）、圆形玻片、细胞培养瓶（75ml）、离心管（15ml、50ml）、血球计数板、6孔板、12孔板、24孔板、96孔板。1.1.3 仪器名称型号 来源酶标仪BioTek powerwave XS2Gene公司CO2 培养箱Themo Forma 3110 seriesThemo公司Bio-Rad凝胶成像系统美国激光扫描共聚焦显微镜Olympus Fluoview 500 IX71日本Olympus公司pH计PHS-320成都世纪方舟科技有限公司离心机Biofuge Stratos德国 Eppendorf超纯水仪Direct-Q美国Millipore摇床海门市其林贝尔仪器有限公司生化培养箱HRSP-250B海尔制冰机N35S 意大利冰箱青岛海尔冰柜青岛海尔电泳仪PAC-3000美国Bio-Rad水浴箱HH-2北京长源移液器E933芬兰Finnepiette紫外投射分析仪UV-140北京六仪凝胶成像系统EQ美国Bio-Rad微型漩涡振荡器WH-3上海沪西分析仪器厂有限公司微波炉格力倒置荧光相差显微镜TH4-200Olympus倒置显微镜 AE20Motic超微量分光光度计NanoVue plusGE电子天平JY5002上海精华超净工作台AIR-TECH苏净集团安泰公司高压灭菌器MLS-3750美国热电烘箱SUT6420青岛海尔1.2 研究对象本实验选取小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)，经pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒质粒细胞转染诱导形成为线粒体自噬试验模型，PC12细胞是一种属于交感神经系统的肿瘤细胞，是儿茶酚胺能细胞，同时具备神经分泌细胞和神经元的特性，被广泛应用在细胞凋亡以及自噬，或是与其相关疾病诱因或治疗方法的体外研究。1.3 实验方法1.3.1 PC12细胞的培养从液氮罐中取出冻存细胞，立即37水浴融化。将细胞用移液枪吸入新的离心管，加入1ml DMEM完全培养基（含10%热灭活胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml），轻轻混匀，800r/min离心5min。轻轻地吸去上清，加入2ml DMEM完全培养基重悬细胞，转入培养瓶中，补足4ml。然后放置于37 5%CO2培养箱培养中培养，每2-3天换一次液。观察细胞生长情况待细胞生长至90%融合度以上即可进行传代培养，首先弃去旧的培养基，加入2ml D-hanks液清洗细胞和培养瓶，轻微摇晃后用移液枪吸出D-hanks液。其次加入1ml 0.25%的胰蛋白酶消化细胞，轻轻摇晃培养瓶，让胰酶和培养瓶壁充分接触，至小片细胞开始脱落。加入3ml DMEM完全培养基终止消化，并用移液器吸取瓶中培养基不断吹匀至单细胞。将上述细胞悬液转移至离心管，800r/min离心5min，弃上清。加入2ml DMEM完全培养基重悬细胞，分别取出1ml细胞悬液加入新培养瓶中，补足至4mlDMEM培养基。37 5%CO2培养箱中继续培养。1.3.2 pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒瞬时转染把实验分为4组，每组有3个复孔，重复3次实验取上述传代细胞中对数期生长期的PC12细胞，接种于6孔板中（首先用细胞板计数并适当稀释，最终加入体积为3ml/孔，接种量3105个/孔）。然后继续置于37 5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至70%融合时，按照MegaTran 1.0转染试剂盒说明书进行质粒转染。在6孔板中加入0.5,1,2, 3g的 pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒。首先各用300L Opti-MEMI稀释，漩涡震荡混匀。再加入9L Mega Tran 1.0转染试剂，立即漩涡震荡10s，室温静置10min。然后把MegaTran 1.0质粒转染混合液缓慢加入DMEM完全培养基中，轻柔振荡混合均匀。37 5%CO2培养箱继续培养4h，并更换新鲜培养基，然后继续培养24h。1.3.3 Western blot检测质粒转染后相关蛋白表达先取出6孔板，弃去废液，用1ml /孔0.25%的胰酶消化，轻微转动摇晃，待细胞成片脱落，收集各组细胞。而后在各组细胞中加入250ul ripa裂解液冰上裂解细胞30min，并在过程中混匀3-5次 。待裂解完成，于4 14000g离心15min收集裂解上清液。然后用BCA法测定蛋白浓度，-20保存备用。取获得的蛋白溶液进行Western blot，检测相关蛋白表达情况。配置蛋白样品：每孔加入量30ul=RO水体积+1Loading buffer体积+蛋白加入量60ug/蛋白浓度。将样品混匀，在沸水中加热10min。样品离心，离心机点动至7500r松开手，待自然停止。制胶：上样30ul/孔。样品左边或右边加入2ul Marker。电泳：刚开始以80V 电压跑30min，然后增加电压至100V，跑完分离胶即可关机。转膜：将凝胶上无蛋白和不需要的地方切去，并剪出约同等大小的PVDF膜（事先用甲醇活化，活化时间1530s），在低温环境下转膜60min。封闭：用1%的脱脂奶粉将膜浸泡，在蛋白脱色摇床上封闭1h。孵育一抗：分别用Anti-LC3B 1:1000,Anti-NIX 1:1000, Anti-Beclin-1 1:1000, Anti-Hsc70 1:1000,Anti-FLAG 1:1000,Anti-actin 1:10000 孵育PVDF膜，4过夜。回收一抗：用TBST洗膜3次，15min/次。在蛋白质脱色摇床上洗，且蛋白面朝下。孵育二抗：用二抗(HRP标记的羊抗兔或鼠二抗1:2000) 37孵育1h。回收二抗：按照TBST-TBST-TBS的顺序洗膜，5min/次。用ECL化学发光法检测相关蛋白的表达情况。取1.5ml的EP管，加入900L ddH2O，然后加入50L 20A液和50L 20B液，混合均匀即为ECL工作液（配制后请尽快使用）。用平头镊将PVDF膜取出，用滤纸略吸去多余的TBS液体(切勿大力接触PVDF膜的蛋白面)，然后放置在一洁净保鲜膜上。根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml ECL工作液的标准，滴加适量ECL工作液到膜上，确保使工作液均匀且完全浸润蛋白膜，放置1-2分钟。取出约莫同膜大小的X胶片，用吸水纸略吸去过多的液体。将胶片放在两片保鲜膜中间，小心赶尽气泡。将膜和胶片固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据X胶片发光结果再调整压片时间。1.3.4 免疫荧光技术检测质粒转染后细胞中的自噬水平首先在24孔板中放入灭菌圆形玻片，1片/孔，每孔加入800l 0.05mol/l P-Lys（多聚赖氨酸），包被过夜。然后用移液器吸去包被液，加入D-hanks液清洗2-3次，并在超净工作台内开盖照紫外10min。然后取上述复苏培养的对数期PC12细胞，按照5104个/孔，加入24孔板中，且每孔添加1ml DMEM完全培养基，置于37 5%CO2培养箱培养24h。待细胞生长至70%融合时，按照MegaTran 1.0转染试剂盒说明书进行质粒转染。分别取pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒0.5g,1g,2g,3g。然后均用300L Opti-MEMI稀释，漩涡震荡混匀。再加入9L Mega Tran 1.0转染试剂，立即漩涡震荡10s，室温静置10min。其次把MegaTran 1.0质粒转染混合液缓慢加入24孔板DMEM完全培养基中，轻柔振荡混合均匀。然后37培养4h后更换新鲜培养液，继续培养24h。待各组细胞处理12h后，弃去培养基，0.01M PBS洗涤三次。然后加入1ml 4%多聚甲醛固定30 min。其次弃去多聚甲醛，用PBS洗涤三次，每次5min。然后使用含有羊血清的封闭液室温封闭1h，400l/孔。弃去封闭液，一抗(LC3B 1:200、Tom20 1:100) 4孵育过夜。弃去一抗，PBS洗涤3次，每次5min。再加荧光标记的二抗(1:1000)和核染料DAPI(1:1000)孵育1h。弃去二抗，PBS洗涤3次，每次5min。最后封片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察照相。1.3.5数据统计分析运用SPSS 19.0统计软件处理数据，组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P0.05); *: p0.05); *: p0.012.2 Western blot检测各组细胞中LC3-I和LC3-II的表达情况利用Western blot检测各组细胞中LC3-I和LC3-II的表达情况，结果表明随着pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染质量的增加，PC12细胞中LC3-II的表达也呈增长趋势（图2-5）。进一步的统计分析结果显示，随着pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染浓度梯度的增加，衡量细胞自噬水平的LC3-II/LC3-I比值也呈梯度增长趋势（图2-6）。图2-5 Western blot检测各组细胞中LC3-I和LC3-II的表达情况Fig 2-5 Western blot of LC3-I and LC3-II in PC12 cells 0.5, 1, 2, 3: PC12 cells transfected with 0.5, 1, 2, 3g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX respectively图2-6 各组细胞中LC3-I和LC3-II表达的统计分析Fig 2-6 analysis of LC3-I and LC3-II in PC12 cells0.5, 1, 2, 3: PC12 cells transfected with 0.5, 1, 2, 3g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX respectively1, 2, 3 vs 0.5; *: p0.05; *: p0.012.3 Western blot检测各组细胞中Beclin-1的表达情况使用Beclin-1抗体检测各组细胞中Beclin-1蛋白的表达情况，实验结果表明转染pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒的各组细胞中均有Beclin-1蛋白（60kD）的表达（图2-7）。而进一步通过对各组细胞中Beclin-1蛋白的表达水平进行统计学分析，结果表明随着pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染浓度的增加，PC12细胞中Beclin-1蛋白的表达呈梯度增长（图2-8）。图2-7 Western blot检测各组细胞中Beclin-1的表达情况Fig 2-7 Western blot of Beclin-1 in PC12 cells 0.5, 1, 2, 3: PC12 cells transfected with 0.5, 1, 2, 3g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX respectively图2-8 各组细胞中Beclin-1表达的统计分析Fig 2-8 analysis of Beclin-1 in PC12 cells0.5, 1, 2, 3: PC12 cells transfected with 0.5, 1, 2, 3g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX respectively1, 2, 3 vs 0.5; *: p0.05); *: p0.05; *: p0.05)2.6荧光显微镜观察各组细胞中EGFP-LC3的表达情况使用荧光显微镜观察各组细胞中EGFP-LC3的表达情况，结果显示0.5g NIX质粒转染时，有少量绿色荧光（图2-13A,B），随着NIX质粒转染量的增多，pc12细胞中自噬荧光点也增多，表明随着NIX质粒转染量的增加，pc12细胞中EGFP-LC3的表达水平呈上升趋势（图2-13 ）。图2-13 荧光显微镜观察各组细胞中EGFP-LC3的表达情况Fig 2-13 Fluorescence microscopy of EGFP-LC3 in PC12 cellsA, B: PC12 cells transfected with 0.5g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX C, D: PC12 cells transfected with 1g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX E, F: PC12 cells transfected with 2g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIXG, H: PC12 cells transfected with 3g pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX green: EGFP-LC3, bar: 10m3 讨论通过使用NIX抗体和FLAG抗体检测不同浓度梯度的转染pc12细胞中融合蛋白FLAG-NIX的表达情况，我们发现两种抗体都可以检测融合蛋白FLAG-NIX的表达，而进一步的统计分析显示二者的趋势较一致都是随着pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染浓度的增加PC12细胞中FLAG-NIX融合蛋白的表达呈梯度增长（图2-1、2-2、2-3、2-4）。这表明pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒成功转染pc12细胞，此外利用荧光显微镜技术检测各组细胞中EGFP-LC3的表达情况的结果也证实了这一点，这为后续的实验提供了有力的根据。在图2-6中，我们用LC3-II/LC3-I比值作统计分析而不是用LC3-II/-actin 比值来统计分析，查阅相关文献可知，细胞内有两种类型的LC3 蛋白存在即LC3-I和LC3-II。LC3-I散在分布于细胞浆内，当自噬体形成后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)偶联形成LC3-II并定位于自噬体内膜和外膜。与其他一些定位于自噬性结构膜上的Atg 蛋白不同(仅在自噬过程的某一阶段发挥作用)，LC3-始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合15。因此，人们把LC3-II蛋白称为自噬标志蛋白， 用LC3-II/LC3-I比值来表示细胞自噬水平。由图2-7,2-8可知，随着pcDNA3.1(+)-N2-FLAG-NIX质粒转染浓度的增加，PC12细胞中Beclin-1蛋白的表达呈梯度增长，这表明Beclin-1可能与NIX诱导pc12细胞自噬有关。有文献报道，Beclin1 是自噬体( autophagosome) 形成过程中的一个必需分子，它Beclin-1能够与BCL-2/BCL-XL结合，然后形成Beclin-1-BCL-2/BCL-XL复合物介导其它自噬蛋白定位于吞噬泡( phagophore)，从而调控哺乳动物自噬体的形成与成熟。而NIX可能通过竞争性阻断Beclin-1与BCL-2/BCL-XL的结合，与BCL-2/BCL-XL形成复合物，释放Beclin-1，进而激活自噬过程16，因此，自噬过程中Beclin-1的表达水平往往会上升，这与本实验结果基本一致。利用Western blot检测各组细胞中Uchl-1的表达情况主要是想了解pc12细胞自噬与Uchl-1是否存在关联，从实验结果（图2-10）可知，NIX诱导的pc12细胞自噬可能与Uchl-1蛋白的表达有关。同理，我们使用Hsc70抗体检测各组细胞中Hsc70蛋白的表达情况，以研究NIX蛋白是否可能通过引起分子伴侣介导的自噬而不是通过诱导细胞自噬，然而，实验结果表明Hsc70蛋白的表达与NIX质粒转染量的多少并没有关联，从而进一步否认这一推断。因此，我们有理由相信NIX蛋白可诱导PC12细胞自噬，其分子机制可能与LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1蛋白和Uchl1蛋白有关而与Hsc70蛋白没有明显关系。结 论NIX蛋白可诱导PC12细胞自噬，其分子机制可能与LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1蛋白和Uchl1蛋白有关。参考文献 1 Yorimitsu T, Klionsky D J .Autophagy :molecular machinery for selfeating J .Cell Death Differ , 2005 , 12 Suppl 2 :1542-1552 2 Dereti c V.Autophagy in innate and adapt ive immunity J .Trends Immunol , 2005 , 26(10):523-528 3 Crotzer V L, Blum J S .Autophagy and intracellular survei llance: Modulating MHC class antigen presentation with stress J .Proc Natl Acad S ci USA, 2005 , 102(22):7779-77804Boyd JM, Malstrom S, Subramanian T, et al. Adenovirus E1B 19 kDa and Bcl-2 proteins interact with a common set of cellular proteins J. Cell. 1994;79:341351.5Matsushima M, Fujiwara T, Takahashi E, et al. Isolation, mapping, and functional analysis of a novel human cDNA (BNIP3L) encoding a protein homologous to human NIP3 J. Genes Chromosomes Cancer. 1998;21:230235. 6Chen G, Ray R, Dubik D, et al. The E1B 19K/Bcl-2-binding protein Nip3 is a dimeric mitochondrial protein that activates apoptosis J. Exp Med.1997;186:19751983. 7Zhang J, Ney PA, et al Role of BNIP3 and NIX in cell death , autophagy , and mitophagy J. Cell Death Differ , 2009 , 16(7):939-946 .8 Gerald W Dorn II. Nix Nought Nothing: fairy tale or real dealJ. Mol Cell Cardiol 2011; 51(4):497-500.9Real PJ, Benito A, Cuevas J, et al. Blockade of epidermal growth factor receptors chemosensitizes breast cancer cells through up-regulation of Bnip3LJ. Cancer Res,2005, 65(18):8151-8157.10 Ding WX, Ni HM, Li M, et al. Nix is critical to two distinct phases of mitophagy, reactive oxygen species-mediated autophagy induction and Parkin-ubiquitin-p62-mediated mitochondrial primingJ. Biol Chem 2010; 285(36):27879-90.11Novak I, Kirkin V, McEwan DG, et al. Nix is a selective autophagy receptor for mitochondrial clearanceJ. EMBO Reports 2010; 11(1):45-51.12Schweers RL, Zhang J, Randall MS, et al. NIX is required for programmed mitochondrial clearance during reticulocyte maturationJ. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(49):19500-5.13Sandoval H, Thiagarajan P, Dasgu