土壤酶测定方法

土壤磷酸酶（酸性）磷酸苯二钠比色法（一）试剂1. pH5醋酸盐缓冲液：A:0.2mol/L 醋酸溶液（11.55ml稀释至1000ml）B:0.2mol/L醋酸钠溶液 A液14.8ml+B液35.2ml稀释至100ml若使用无水乙酸及乙酸钠配制1升0.2MPH为5.0的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算如下：无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为17.5M，则需无水乙酸的体积为0.0711000/17.5=4.1（毫升）；乙酸钠用量的计算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82，则需无水乙酸钠的质量为0.13821=11（克）。使用无水乙酸及乙酸钠配制1升0.2MPH为5.0的乙酸盐缓冲液的方法如下：用量筒量取4.1毫升无水乙酸至1000毫升烧杯内，再用台秤称取无水乙酸钠11克至该烧杯，然后用量筒量取1000-4.1=996毫升蒸馏水至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并呈均匀的溶液即为1升0.2MPH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。或者：量7ml 0.2M醋酸钠液+3ml 0.2M醋酸液混合即得。2. 0.5%磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液3. 氯代二溴对苯醌亚胺：称取0.125g 2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇（48ml乙醇+2ml水）溶解，贮存于棕色瓶中，存放在冰箱中，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。4. 酚标准溶液：酚原液-取1g苯酚溶于蒸馏水中，定容至1000ml水中，保存于棕色瓶中。酚工作液-取10 ml酚原液稀释至1000ml水中，每毫升含0.01mg酚5. 甲苯6.0.3%硫酸铝溶液，称取0.3g硫酸铝，定容至100ml。（二）实验步骤1. 标线制作取0，1，3，5，7，9，11，13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。2. 样品测定称取风干土样（过20目筛，去除杂质）5.0000g，放置于200ml容量瓶（离心管）中，加2.5ml甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠，仔细摇匀后放置于37C恒温箱中培养24h，后于培养液中加入0.3%硫酸铝溶液过滤。吸取滤液3ml于50ml比色管中，按标准曲线方法显色，于波长578nm处测定颜色的深度，读取吸光值。对每一土样，设置用10mL水代替磷酸苯二钠基质的对照。并作空白无土对照。（三）数据计算以24小时每克土壤中释放出的酚的毫克数表示。土壤脲酶活性测定：靛酚比色法试验步骤：试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/L NaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：A：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升，存于冰箱中；B：27克NaOH溶于100毫升水，存于冰箱中。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升备用。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。如购买的溶液是含10%活性氯的，则计算如下：10%*原液体积（配100ml）=0.9%（100ml+需加水）6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，加蒸馏水定容至100ml，吸取稀释的标准液1，3，5，7，9，11，13ml，移至50ml容量瓶，加蒸馏水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟后显色,用水稀释至刻度。1h内将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。1) 称取10g（5g）过20目筛的风干土样于100ml（50ml）三角瓶中。2) 向容量瓶中加入2ml（1ml）甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟。3) 之后加入20ml （10ml）10尿素溶液和40ml（20ml）柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合。4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。与此同时,进行以水代替基质(10ml 10%尿素用10ml蒸馏水代替),及无土对照测定。6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入20ml（10ml）蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色。7) 1h内在（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照。9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3N的毫克数表示。M（X样品X无土X无基质）*100*10式中：M土壤脲酶活性值X样品样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数X无土无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数X无基质无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数100 样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 酶活性单位的土重与样品土重之比值若土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3N的毫克数表示的话，计算如下：M=a*2a样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数。2换算成1g土的系数。土壤蔗糖还原酶测定方法酶促反应试剂：1) 8%蔗糖溶液：称取8g蔗糖溶解，定容至100ml。2) pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO42H2O溶于1L蒸馏水）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。3）甲苯4)3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml 2mol/L NaOH和50ml水中,再加30g酒石酸钾钠,用水稀释定容至100ml(保存期不过7天)。三、操作步骤(1)标准曲线绘制：将葡萄糖现在50-58条件下真空干燥至恒重，然后称取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5mg还原糖/ml）,即成标准葡萄糖标液。吸5mg/mL的标准葡糖糖溶液10m1于100ml容量瓶中,定容。从中吸取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2、3m1于50m1容量瓶,加DNS试剂3mL混匀,于沸水浴中准确反应5min(从试管放入重新沸腾时算起),取出立即冷水浴中冷却至室温，定容。即为浓度为0ppm、2ppm、4ppm、8ppm12ppm、15ppm、20ppm、30ppm的标准曲线。以空白管调零在波长508nm处比色,以0D值为纵坐标,以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。(2)土壤蔗糖酶测定称取10.00g土壤,置于100mL容量瓶中,注入30ml 8%蔗糖溶液,10mlpH5.5磷酸缓冲液和1m1甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37下培养24h。到时取出,迅速过滤。从中吸取滤液2-10ml（1ml）(适量,无蔗糖对照吸取20m1),注入50ml容量瓶中,加3m1DNS试剂,并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50m1,并在分光光度计上于508mm处进行比色。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个试验需做无土壤对照:如果样品吸光值超标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样。)（3）结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。葡萄糖（毫克）=a*4 a代表从标准曲线查到的葡萄糖毫克数4代表换算成1克土的系数过氧化氢酶活性测定容量法1.试剂配制a.0.3%过氧化氢溶液:将10m130%的过氧化氢用水稀释至1L,此溶液不稳定,需临时配置。b.1.5mol/L硫酸:8.4ml浓硫酸溶于水,再用蒸馏水稀释至100mlc.0.002mol/L KMnO4溶液:称取化学纯高锰酸钾0.3161g,溶于1升蒸馏水中,贮于棕色瓶中,备用。如果知道酶活性很高的话可以适当变化高锰酸钾浓度2.操作步骤(1)取5g（2g）过1mm风于土,置于150mL（100ml）三角瓶中,并注入10mL（40ml）蒸馏水和5mL0.3% H2O2溶液。(2)同时设置对照,即三角瓶中注入10mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液,而不加土样，并作无士对照。(3)将三角瓶放在振荡机振荡(120r/min)30min后,加入5mL 1.5mol/L硫酸,以稳定未分解的过氧化氢,再将瓶中是悬液用慢速型滤纸过滤，吸取25mL滤液,用0.002mo1/L高锰酸钾滴定至淡粉色终点。(30s不退色)3.结果计算以单位土重消耗的0.002mol/L高锰酸钾毫升数(对照与试验测定的差)表示土壤过氧化氢酶活性,其计算式为:土壤过氧化氢酶活性(ml KMn04/g干土)=(V0-V)/m式中,V0:为滴定空白(25ml过氧化氢)所消耗的高锰酸钾毫升数(m1)V:为滴定试样所消耗的高锰酸钾毫升数(ml)m为烘干土壤重量(g) 或者：30min后1g土壤过氧化氢酶活性=(V0-V)*T（T为高锰酸钾滴定度