第五章__植物离体快速繁殖（课堂PPT）

第五章植物离体微繁,主要内容：1.植物离体微繁2.影响植物离体微繁成功的因素3.植物离体微繁过程中常见异常现象及对策,1,植物有哪些繁殖方法？,思考:,2,分株繁殖,压条繁殖,播种繁殖,嫁接繁殖,3,扦插繁殖,组织培养繁殖,4,1.植物离体微繁,植物离体微繁(micropropagation)：是指利用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法，是常规营养繁殖方法的一种扩展和延伸。是在短期内获得大量遗传性状一致的个体的方法。属离体无性繁殖(propagationinvitro)。又称为快速繁殖（rapidcloneprogagation）。,5,植物离体微繁的特点,1.繁殖系数高，繁殖周期短，繁殖速度快：它的高速度是以下三种因素构成的：有较高的增殖倍数;较短的增殖周期；周年生产。2.应用广泛，是推广良种的重要手段：占用空间小，生产效率高，省时、省工、节约土地。3.繁殖材料用量少，不受季节限制，可实现工厂化生产；4.能获得无毒苗木无性系5.木本植物应用潜力大：繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。,6,1.1植物离体微繁过程,第一阶段稳定无菌培养体系的建立时期第二阶段稳定培养系的增殖、生长和增状时期第三阶段诱导茎芽生根形成小苗时期第四阶段生根小苗移栽和驯化时期第五阶段商品苗培育时期,7,第一阶段：稳定无菌培养体系的建立时期,任何植物细胞或组织培养体系的建立，都必须采制适宜的外植体。外植体的选择有什么要求呢？第一，选择优良的种质：易于离体培养的种类、品种、类型；生产或研究上意义比较大的种类、品种、类型。第二，选择健壮的植株：第三，选择合适的部位茎尖：生长速度快，遗传稳定，无病毒分布。但材料来源有限，为此茎段也是重要来源。叶片：采用幼嫩的叶片较好。如：秋海棠、矮牵牛、菊花等。花（花蕾）：据一些学者的观点，在花诱导之前细胞的脱分化容易发生，故外植体常取发育早期阶段的花，即花蕾。胚：大多数花卉都可用胚培养的方式进行快繁，如：百合、羽叶甘蓝、蝴蝶兰、卡特兰等。,8,外植体的选择,第四，取材季节合理：选取外植体的季节和时间，对培养材料的启动和培养至关重要。一般在生长季春夏。第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；第六，选择大小合适的外植体；外植体过大，不易灭菌，过小，不易成活。一般0.5-1cm；脱毒培养0.2-0.5cm。,9,外植体的灭菌,无菌的外植体材料是植物组织培养成功的重要前提与可靠保证，而消毒则是获得无菌外植体的有效方法。取来的外植体需要经过仔细的表面灭菌处理，外植体灭菌常用消毒剂。消毒注意事项：1.正确选择消毒剂种类及浓度、消毒时间，减少组织的死亡.2.在用消毒剂对材料表面消毒后，必须用无菌水漂洗3次以上以除去残留杀菌剂，但用酒精消毒时，则不必漂洗。3.与消毒剂接触过的切面在转移至无菌基质前需切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。4.在外植体污染严重时，应用流水漂洗1h以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。5.Hgcl2效果最好，但较难从外植体去除，对人的伤害也最大，用后要用水冲洗至少5次。,10,外植体的接种和培养,外植体的接种无菌操作外植体表面灭菌切取分离无菌培养基外植体的培养光照、温度、湿度、培养基pH、气体调节,11,接种材料修整与冲洗,12,材料表面灭菌,13,1.叶片0.5cm0.5cm,2.微茎尖0.2-0.5mm,3.带节茎段0.5-1.0cm,外植体切割,4.芽丛分离,14,顶梢切割成0.51.0cm的茎尖；（除叶,剥去休眠芽的鳞片)；茎尖流水冲洗24h；75%酒精迅速漂洗30s；0.1%升汞或稀释20倍的次氯酸钠液消毒58min(取自老枝条上的可适当延长时间)；无菌水冲洗3-5次。,材料处理及消毒,15,外植体接入培养基,16,注意,无菌培养体系的建立需注意下面两个问题：1.采样和表面灭菌；2.首次接种污染率的估算与对策：首次接种，小容器，多数量，尽量分散，互相隔离，效果最好。,17,从植物组织培养积累的知识中，可将植物再生过程划分为四种方式：1)顶芽和腋芽的发育2)不定芽的发育3)体细胞胚状体的发生与发育4)原球茎的发育,第二阶段：稳定培养系的增殖、生长和增状时期（诱导外植体生长与分化）,18,1)顶芽和腋芽的发育,顶芽和腋芽在离体培养中都可被诱导而发育。从芽萌发出苗，即枝条，枝条向上延伸，新形成的芽将逐渐发育。如果将新形成的芽切割下来，使之再萌发出新的枝条，在适当的条件下使枝条生根，并种植到土壤中去，便完成了植物再生的全过程。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时只能采用顶芽，侧芽或带有芽的茎切段，其它如种子，萌发后取枝条等也可以。,19,幼嫩茎尖,营养芽,20,茎尖培养,在顶芽的培养中，还有较为特殊的一种方式，即采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织为材料，由它作为外植体。过去常被称为“分生组织培养”，但目前多数学者认为以称作“茎尖培养”为宜。真正的茎尖分生组织是被限制在一极小的范围内，那里的细胞几乎没有分化，在活跃地进行细胞分裂，保持着强烈的再生分化能力，这个部分不包括叶原基，处于茎的极顶尖处。,21,根据培养目的和取材大小分为：微茎尖培养普通茎尖培养,茎尖培养类型,22,普通茎尖指几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽,23,微茎尖为0.3-0.5mm,24,普通茎尖培养方法,取材,材料处理及消毒,培养,接种,驯化移栽,25,直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（12cm）（取前可喷杀菌药），取顶芽或侧芽。从试管苗获取。,取材,取1-2顶梢,26,茎尖培养时需要注意的问题,一般都采用稍大一些的茎尖来培养。之所以用茎尖培养，是为了脱除病毒病的危害，因为只有茎尖未受病毒侵染。如果是经过病毒鉴定的母株，或该种植物有无病毒并不在考虑之中，当然最好是采用腋芽，或带腋芽的茎切段。过小的茎尖只有很低的存活率，并且最初生长太慢。如果某些植物具有比较强的顶端优势，那么在培养中也同样有所表现，往往顶芽抑制侧芽的萌发，这样总是获得分枝很少的独立的枝条，限制了繁殖的速度，通常采取切除顶芽和适当增加细胞分裂素两项措施加以克服。,27,茎段培养过程,将经过表面消毒的茎段在无菌条件下，切成几厘米长带芽的节段，接种在固体培养基上。经过培养后，茎段可直接发生不定芽，或先诱导形成愈伤组织，再脱分化形成再生苗。把再生苗进行切割，转接到生根培养基上培养，便可得到完整的小植株。,28,图示茎段培养过程,去叶片用自来水冲洗,29,2)不定芽的发育,在培养中由外植体产生不定芽分化，通常经历两个不同的生长时期：首先外植体要经脱分化过程，形成或不形成愈伤组织；第二步由已脱分化的细胞或新形成的愈伤组织细胞，再分化形成一些分生细胞团。然后由这些分生组织形成器官原基，在构成器官的纵轴上表现出单向的极性。,30,3)体细胞胚状体的发生与发育,体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。通过体细胞胚状体的发生，来进行无性系的大量繁殖具有极大的潜力。其特点是：成苗数量多，速度快，结构完整。,31,体细胞胚状体的发生方式,胚状体产生的五种方式：由外植体的表皮细胞直接产生胚状体；由外植体组织内部的细胞产生胚状体；由愈伤组织的表面细胞产生胚状体；由胚性细胞复合体的表面细胞产生胚状体；由单个游离细胞直接产生胚状体。,32,4）原球茎的发育,大部分兰花的培养属于这一类型。原球茎特点:缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。原球茎是一种类胚组织，培养兰花的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，继而分化成植株，也可继代增殖为原球茎。特点：受材料的局限性较大。,33,初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。,小结,34,在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，也难以直接种植到栽培介质中去，这些培养的材料可统称为中间繁殖体，它们需要进一步培养增殖，使之越来越多，才能发挥快速繁殖的优势。在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。,第三阶段：诱导茎芽生根形成小苗时期,35,继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。,继代培养,36,继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。,继代培养中扩繁的方法,37,在中间繁殖体增殖到一定数量后，就使部分培养物分流，进入壮苗与生根途径。试管内生根或壮苗阶段的意义：试管内生根或壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，也是使试管苗适应外部环境的一个过渡时期。在生根壮苗培养基上，大多数植物要分离成单苗，有的可分成小丛苗，转移培养后应停止增殖，迅速生根，同时苗也长高了，以后便于移栽。,38,茎芽生根诱导的途径：1、是试管（瓶）内生根2、是试管（瓶）外生根,39,5.2.3.1试管内生根将长到一定长度的微枝转移到生根培养基上继续培养。（IBANAA）植物离体培养产生的跟为不定根，依据根形成的部位又分为皮部根和愈伤根。,40,思考:皮部根和愈伤根哪个利于组织培养？为什么,41,判断试管苗生根好坏依据：1、根系质量（粗度、长度）2、根系数量（条数，毛细根）,42,5.2.3.2试管外生根试管外生根技术是将组织培养茎芽的生根诱导同驯化培养结合在一起，直接将茎芽扦插到试管外有菌环境中，边诱导生根边驯化培养。,优势：1、试管外生根苗比试管内生根苗生理活性更好；2、经济成本相对试管内生根要低很多,43,第四阶段：生根小苗移栽和驯化时期,44,试管苗的特点及移栽,从以下三个方面讲述:1.试管苗的生长环境；2.试管苗的弱点；3.克服弱点，提高移栽成活率的措施。,45,试管苗的生长环境,无菌异养高温弱光恒湿,46,试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度、近100的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。,克服弱点，提高移栽成活率的措施,47,移栽前的准备,A.试管苗壮苗加入生长控制剂，如多效唑，B9（丁酰肼），CCC（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。,48,B.试管苗炼苗,移栽前可将培养物不打开瓶口移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-3d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。,49,试管苗的移栽,试管苗的移栽要注意以下几点;首先，要保持小苗的水分供需平衡。第二，要选择恰当的种植介质，最要紧的是疏松透气，适宜的保水性，容易灭菌处理，不利于杂菌滋生。常用的有粗粒状蛭石、珍珠岩、粗沙、炉灰渣、谷壳(或谷壳灰)、锯木屑等，或者将它们以一定的比例混合使用。第三，要防止菌类滋生。试管苗原来的环境是无菌的，种植出来以后难以保持完全无菌，但应尽量不使菌类大量滋生，以利于试管苗成活。第四，要注意一定的光、温条件。一般强度较高的慢射光较好。第五，再生植株的鉴定：是指用细胞学或形态学等方法检查再生植株是否有遗传变异。,50,试管苗的移栽基质,泥炭,珍珠岩,椰糠,51,提高小苗移栽成活率的方法：,第一、将小苗分级第二、要进行炼苗第三、选好定植场所第四、要严格掌握移栽技术，科学确定合适的移栽时间第五、重视移栽后的管理,52,提高效益的措施,a.提高技能，提高生产效率；b.减少投资，延长设备使用寿命；c.实施简化培养；d.节约水电。,53,5.3植物离体快速繁殖的影响因素,54,主要内容,5.3.1影响组培苗快繁的内因5.3.2影响组培苗快繁的外因,55,5.3.1影响组培苗快繁的内因,5.3.1.1植物材料（外植体）的影响5.3.1.2继代培养的次数5.3.1.3愈伤组织的遗传特性及其生理状态5.3.1.4植物离体分化过程类型的影响,56,5.3.1.1植物材料（外植体）的影响,外植体的影响包括：外植体的基因型、外植体的类型及其生理状态、外植体的大小、取材植株的年龄及生理状态等。在植物组织培养中，基因型的影响是非常突出的问题，可能原因：基因对激素需求有一定的控制作用。,57,在植物组织培养中一般来说增值能力草本木本；被子植物裸子植物；年幼材料老年材料；刚分离组织已继代的组织；胚营养体组织；芽胚状体愈伤组织。,58,5.3.1.2继代培养,(1)形态发生能力的保持或丧失；(2)培养中发生的变异(3)继代培养时间长短(4)季节,59,(1)形态发生能力的保持或丧失；,在大多数以顶芽或腋芽增殖方式繁殖的植物中，在培养许多代之后，仍然保持着旺盛的增殖能力，对于这种类型，似乎不大会出现形态发生能力削弱或丧失的问题，它们完全类似于常规的无性繁殖，只不过微型化了而已；采用细胞培养或愈伤组织培养的研究，需要关心着形态发生能力是否能持久。形态发生能力减弱或丧失大多由三个因素造成：,60,形态发生能力减弱或丧失大多由三个因素造成：,a.愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心(分生组织)，当重复继代时会逐渐减少至丧失当它们不存在时，其它的愈伤组织难以再诱导形成成器官中心，这些愈伤组织不能形成维管束，而始终保持着无组织结构的细胞分裂；b.形态发生潜力的丧失，可能是由于内源生长调节物质的减少；c.不正常染色体聚集可能会抑制发育过程。,61,(2)培养中发生的变异,培养中的细胞团，由于不断的继代使不正常植株产生的频率增加，变异的范围相当广泛。表现型变异：叶形态变异，花青素颜色丧失，绒毛丧失，变侏儒，花的形态变异等；染色体数目和结构的改变可以产生变异；细胞核和细胞质的基因突变；核外基因组的分离导致变异；非遗传的生理适应变异。,62,(3)继代培养时间长短,关于继代培养次数对繁殖率的影响报道不一：有的材料长期继代可保持原来的再生能力和增殖率，如葡萄；有的经过一定时间继代培养后才有分化再生能力，如沙枣；有的随继代时间加长而分化再生能力降低，如杜鹃。,63,(4)季节,有些植物材料能否继代与季节有关，主要原因是：继代中有休眠现象。,64,5.3.1.3愈伤组织的遗传特性及其生理状态,其影响主要通过：a、诱导愈伤组织进行离体培养时，培养基的成分及培养条件均能影响愈伤组织的生理状态，进而影响其再生能力b、愈伤组织在增殖培养基上培养的时间越久或代数越多，转移到分化培养基上，形态发生越困难c、体积大不利于分化一般选取生长旺盛的愈伤组织进行转分化培养,65,5.3.1.4芽的增殖途径,芽及嫩梢的增殖是微繁的关键时期，芽的增殖途径一般有一下5种：A、嫩梢扦插增殖途径：又称节培法或微型扦插法，由单芽茎段增殖成苗。特点：一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，适用范围大，移栽容易成活。主要适用:一些增殖培养比较困难，顶端优势明显或生长迅速，或对组培苗质量要求比较高的木本植物。关键在于外植体芽位的选取B、丛生芽增殖型茎尖或初代培养的芽发生腋芽丛生芽。特点：遗传性状稳定，茎尖培养，脱毒苗。适合于大规模的商业化生产，也是植物茎尖脱毒培养的必经之路,66,5.3.1.4芽的增殖途径,C、器官发生型从植物叶片、子房、花药、胚珠、叶柄等诱导出愈伤组织；从愈伤组织上诱导不定芽。特点：可创造有益突变体，可能发生变异。D、胚状体发生型从植物叶片、子房、花药、胚珠、未成熟胚等诱导体细胞胚胎发生，其发生和成苗类似合子胚或种子。特点：胚状体具有数量多、结构稳定、易成苗和繁殖速度快的特点，有变异。,67,5.3.1.4芽的增殖途径,E、原球茎型原球茎是一种类胚组织，培养兰花的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，继而分化成植株，也可继代增殖为原球茎。特点：受材料的局限性较大。,68,5.3.2影响组培苗快繁的外因,5.3.2.1培养基对植物快速繁殖的影响5.3.2.2培养条件,69,5.3.2.1培养基对植物快速繁殖的影响,（1）无机盐（2）糖浓度（3）维生素（4）生长素和细胞分裂素（5）其它有机化合物,70,（1）无机盐,MS培养基可以适用于许多植物的组织培养。但在大量组织器官培养中发现，由于其无机盐浓度较高，对某些植物来说出现了抑制生长甚至毒害作用。此时应选用低盐浓度的培养基，或降低盐浓度的方法一试是很必要的。,71,（2）糖浓度,糖类具有维持培养基渗透压的作用，在培养过程中，组织不断地从培养基中吸取糖类物质，随时间增长，逐步降低了糖的浓度，不能维持正常的渗透压，这种情况下应尽快将材料转移至新鲜的培养基，否则影响试管苗的生长。另外适宜的糖浓度对器官的发生也有重要作用。蔗糖在高压灭菌时产生一种降解产物5-羟甲基糖醛，应引起重视。,72,（3）维生素,维生素主要是影响基础的生物化学代谢，进而影响新陈代谢，并对形态发生产生影响。在培养过程中，所用的维生素类绝大多数为B族维生素，如硫胺素、烟酸、叶酸、生物素等，它们以各种辅酶的形式参与代谢活动，影响形态发生、分化及试管苗的生长。,73,（4）生长素和细胞分裂素,植物生长调节物质，在试管苗增殖过程中起着决定性的作用。由于植物体内源激素难以测定。因此，外源激素的加入靠一系列的试验来修正。生长素和细胞分裂素对植物快速繁殖的影响主要表现在以下几个方面:,74,激素对植物快速繁殖的影响,培养物对激素的需求量取决于它本身内源激素的水平，这一水平又随着植物种类、组织的部位以及生长期的条件而变动。有效地诱导一种植物产生苗或促进嫩茎良好地增殖，所要求的细胞分裂素和生长素的种类与数量有不少变化，通常只有一系列的预备实验加以确定。植物组织和细胞对细胞分裂素的需求量，既取决于遗传因素也取决于后天因素。生长素浓度过高，培养物表现发生旺盛生长的愈伤组织，细胞团较松散，出现水浸状，细胞较大，液泡较大不可能分化出苗；生长素含量不足，组织块几乎不能生长；某些生长素如2,4-D用量过高，形态发生能力迅速丧失，或较长时间内不能恢复；双子叶植物要求较低，单子叶植物要求较高。,75,激素对植物快速繁殖的影响,因此，从实用的观点出发，从比较迅速、简便地达到快速繁殖的目的出发，只能是在现有的关于细胞的全能性知识，植物激素知识以及已分化成功的同种、同属植物的经验等基础上，用几组不同的激素配比实验进行试验来解决问题。将大量试验报告汇集之后，将会渐渐理出理论的轮廓。最终我们将发现，阐明细胞分化或不定芽发生，要比我们想象的复杂得多。,76,（5）其它有机化合物,因不同的原因和需要，用于培养基中的有机化合物，种类相当丰富。例如：氨基酸腺嘌呤肌醇促进植物组织的生长。活性炭,77,5.3.2.2培养条件,A、光照光照的主要作用是在形态建成的诱导方面，它涉及到植物细胞分化的若干重要过程。光是茎的发端和根生长的关键因子，在黑暗中培养的愈伤组织，当转移到光下时便产生茎；光也抑制许多植物根的生长。光效应可再细分为光周期、光强度和光的波长，试管培养物在形态学上的需求，可由一至数个上述因子所满足。,78,5.3.2.2培养条件,B、温度不同植物增殖的最适温度不同，大多采用252的温度。C、气体状况试管苗生长和繁殖需要氧气，进行固体培养时，如果瓶塞密闭或将芽埋入培养基会影响生长和繁殖；培养基经高压灭菌，瓶中可能有乙烯产生，高浓度的乙烯对正常的形态发生是不利因素。乙烯趋向于使培养的细胞无组织结构的增殖。,79,5.4植物离体微繁过程中常见异常现象及其对策,植物离体微繁过程中应注意的主要问题：1)遗传稳定性问题2)褐变问题3)玻璃化问题4)污染问题5)生产成本问题6)市场预测和经营问题,褐变、玻璃化、菌类污染被称为植物组织培养的三大难题，因此，应该特别注意和重视。,80,5.4.1遗传稳定性问题,遗传稳定性问题，即保持原有良种特性问题。下面主要从三方面讲述:A变异的起源及类型B影响遗传稳定性的因素C提高遗传稳定性，减少变异的措施,81,A变异的起源及类型,虽然植物组织培养中可获得大量形态、生理特性不变的植株，但通过愈伤组织或悬浮培养诱导的苗木，经常会出现一些体细胞变异个体，如：观赏植物不开花、花小或花色不正；果树植物不结果、抗性下降或果小；产量低.品质差等问题，在生产上造成很大损失，并容易引起经济纠纷。综合分析，变异的起源及类型如下:原来存在于外植体中的倍数性和遗传组成不同的细胞经诱导后产生新的植株；培养条件可能引起新的不规则性变异；前两种原因同时发挥作用；染色体结构变异、染色体数目变异、嵌合体、基因突变等。,82,B影响遗传稳定性的因素,基因型基因型不同，发生变异的频率也不同。继代次数试管苗的继代培养次数和时间影响植物稳定性，是造成变异的关键因素。一般随继代次数和时间的增加，变异频率不断提高。各种变异发生的频率随组织培养时间的增加而提高。发生方式离体器官发生有5种途径，以茎尖、茎段等发生不定芽的方式繁殖不发生变异或变异率极低；花器(花瓣)诱导的变异较高；通过愈伤组织和悬浮培养分化不定芽的方式获得再生植株变异率较高；通过分化胚状体途径再生植株变异较少；在高浓度的激素作用下，细胞分裂和生长加快，不正常分裂频率增高，再生植株变异也增多。培养基改变其成分可诱导倍数性高的细胞分裂；多倍性与2,4-D有正相关性也有负相关性；物理状态如半固体和液体可诱导产生多倍性。,83,C提高遗传稳定性，减少变异的措施,尽量采用不易发生体细胞变异的增殖途径，以减少或避免植物个体或细胞发生变异。如采用生长点、腋芽生枝、胚状体繁殖方式，可有效地减少变异缩短继代时间，限制继代次数，每隔一定继代次数后，重新开始接外植体进行新的继代培养；取幼年的外植体材料；采用适当的生长调节物质种类和较低的浓度；减少或不使用培养基中容易引起诱变的化学物质；定期检测，及时剔除生理、形态异常苗；确定再生植株的生理学性状和经济性状是否稳定。,84,5.4.2褐变问题,植物组织培养中的褐变，是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不断向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。这个问题分三方面讲述:A）褐变的产生B）影响褐变的因素C）防止褐变的措施,85,A褐变的产生,褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物和多酚类氧化酶活性有直接关系：多酚氧化酶酚类化合物醌类物质（褐色）+水,86,褐变的产生,正常情况下，完整的组织、细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，因而稳定；完整组织、细胞中的酚类化合物从外植体切口处溢出，是一种自我保护反应，可诱导植保素或物理屏障的形式，以防止微生物侵染组织；组织中的多酚氧化酶被激活，使酚类物质被氧化产生棕褐色醌类物质而引起褐变。简单地说:醌类物质的产生，即产生褐变；醌类与外植体组织中的蛋白质在酪氨酸酶的作用下发生聚合，引起其它酶系统失活，造成代谢紊乱生产停滞衰老死亡。,87,B影响褐变的因素,a植物材料b光照c温度d培养基e培养方式,88,a植物材料,基因型不同种植物，同种植物不同类型，不同品种在组培中发生的频率，严重程度有很大差别。木本植物、单宁含量或色素含量高的植物易发生褐变。酚类的糖苷化合物（前体物质）：木质素、单宁、色素材料年龄与生理状态幼龄材料一般比成龄材料褐变轻；幼嫩组织比成熟组织褐变轻（酚类化合物含量少）；取材部位葡萄侧生蔓切茎尖（酚类化合物含量少）比延长蔓切茎尖褐变轻；苹果顶芽比侧芽褐变轻。取材时期酚类化合物含量、多酚氧化酶含量随季节变化而变化；外植体大小及受伤程度外植体大小、切口大小、外植体消毒用药种类处理时间等。,89,b光照,取材之前的暗处理或弱光条件下，能控制外植体褐变，是因为酚类化合物的氧化过程中，需要许多酶系统，其中一部分酶系统的活性是受光诱导的，这些酶在自然光照条件下的植物体内非常活跃。初代培养进行暗处理，有一定的效果；有的处理无效果；有的处理反而加重褐变，原因：光下生长的植物内酚类含量已经很高，接种后放在黑暗中并不能马上降低酚类含量，相反，连续黑暗会降低外植体生理活力，使褐变加重。,90,c温度,低温57，7天，可减轻褐变。,91,d培养基,培养基状态：液体培养基可有效克服外植体褐变，再加上滤纸作为纸桥，效果会更好。原因：外植体溢出的有毒物质可很快扩散。无机盐降低盐浓度则可减少酚类外溢，从而减轻褐变。原因：无机盐中有些离子，如：Mn2+、Cu2+是参与氧化物酚类的组成或辅助因子。植物生长的调节剂6-BA或KT可促成酚类化合物，刺激氧化酶的活性，促进褐变发生；而生长素类如IAA、2,4-D延缓酚类合成，减轻褐变。,92,培养基,抗氧化剂加入抗氧化剂可改变外植体周围的氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。如硫代硫酸钠，苏糖二硫醇、Vc、间苯三酚等。抗氧化剂在液体培养基中效果更好；外植体接种之前，用其浸泡一定时间可收到一定效果。吸附剂活性炭和PVP（聚乙烯吡咯烷酮）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应（注意：吸附时也同时吸附生长调节剂）。螯合剂与酶螯合，降低酶活性。pH值低pH值，降低酶活性和底物利用率。,93,e培养条件与方式,外植体在最适宜的脱分化和再分化条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，可减轻褐变。光照过强，温度过高，培养时间过长，加速褐变。外植体在培养基中的放置方式：薯蓣的茎段，正向插入褐变较重；倒向插入褐变消失。培养方式通气条件；转瓶周期周期短，褐变轻。,94,C褐变的防止措施,三个选择：分生能力强的外植体；合适的无机盐成分浓度、合适的蔗糖浓度和激素水平；适宜的温度、光照、pH等培养条件；两个加入：活性炭(0.10.5%)抗氧化剂（VC、PVP、牛血清、牛蛋白等)；一个连续：连续将材料进行转移。,95,5.4.3玻璃化问题,A玻璃苗的危害B影响玻璃苗发生的因素C玻璃苗中化学成分的变化D玻璃苗发生的机理E防止和克服玻璃苗的措施,96,A玻璃苗的危害,在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是“玻璃化”。是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。玻璃苗中因其体内含水量高、干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；生根困难，移栽后也很难成活。,97,B影响玻璃苗发生的因素,琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关。培养基中6-BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关。非受伤的物理和化学胁迫可以增加乙烯的合成，乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展，乙烯处理破坏了膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累有大量纤维及泡状物质，从而改变组织的生理生化及纤维结构，导致了玻璃化的发生。因此，玻璃化被认为是一种非受伤胁迫条件下形态上的反应。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性低于正常植株。培养瓶内气体与外界交换不畅。培养瓶中高的含N量，特别是高的N-NH4+。不同部位的节段外植体基部节段玻璃苗严重，茎尖最好。,98,C玻璃苗中化学成分的变化,纤维素和木质素含量的变化玻璃苗中纤维素和木质素含量均低于正常苗。玻璃苗的茎尖段和茎基段中纤维素含量均低于正常苗。叶片和茎中纤维素和木质素含量也均低于正常苗。造成玻璃苗中纤维素和木质素含量低的原因是试管苗发生玻璃化过程中，其体内纤维素和木质素合成下降，分解增加，尤其以茎尖段和叶片表现最严重。造成植物体内纤维素和木质素严重缺乏，从而表现为茎，叶呈水浸状，生长不良等玻璃化现象。,99,矿质元素含量的变化,a.多数元素在玻璃苗中的含量均低于正常苗，如：Cl、Au、Na、Sb、Mn、I、k、Fe、As、Zn、Ca、Mg、Co、Al、Br共16种。b.少数苗中Al、As、Br、Sb、Th、La等，培养基中不含这些元素推测它们主要来自琼脂和蔗糖。c.玻璃苗中保卫细胞中K元素含量比正常苗低，P、Al、Zn等元素含量则比正常苗高。,100,D玻璃苗发生的机理,Keversy等的