2019年《分子生物学实验》课程教学大纲

分子生物学实验课程教学大纲课程编号： 05030适用专业： 生物工程与生物技术实验学时数： 36学时实验学分：1教材：主要参考书：分子生物学实验指导 徐庆华等 成栋学院立项教材 2009 一、课程说明分子生物学实验以介绍分子生物学中的实验方法、实验手段和培养学生实验操作技能为其主要内容。需要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，培养学生分析问题和解决问题的能力。通过实验，要求学生能在原有的相关理论知识基础上较全面和深入理解分子生物学基本原理， 掌握基本的分子生物学实验方法和技巧，初步具备一定的实验设计能力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。b5E2RGbCAP本实验课在方法上力求经典，实验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。p1EanqFDPw二、学时分配章 次标 题实验学时每组人数备 注实验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测62综合实验实验二质粒DNA的限制性内切酶消化及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定62验证实验实验三PCR技术体外扩增DNA扩增、产物回收及电泳检测82验证实验实验四大肠杆菌感受态的制备及质粒DNA转化大肠杆菌82综合实验实验五SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量82综合实验三、教学内容及教学基本要求实验一 碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、 实验特点实验类型：综合 实验类别：专业基础 计划学时：6 每组人数：2 二、实验目的1、掌握碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。 2、掌握琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。3、了解质粒DNA的粗略定量方法。三、实验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培养基中，37摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后立即加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置510 min；6、4、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20保存备用。8、取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100加热溶解；9、平衡凝胶槽：放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.51mm）；10、铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50左右倒入凝胶槽，胶厚一般为58mm；DXDiTa9E3d11、待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶23mm，小心拔出梳子；RTCrpUDGiT12、DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）；13、打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm；14、据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止；15、电泳完毕关闭电源，将凝胶放紫外灯下观察并拍照，观察质粒状态并记录结果。四、 实验仪器设备摇床、台式高速离心机、微量移液器、微量EP管、低温冰箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。五、 实验操作要点1、熟练掌握质粒DNA的提取过程和注意事项。2、熟练掌握琼脂糖凝胶的制备过程和电泳检测DNA的方法及注意事项。实验二 质粒DNA的限制性内切酶消化及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一、 实验特点实验类型：验证 实验类别：专业基础 计划学时：6 每组人数：2 二、实验目的1、掌握限制性内切酶的特性。2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法。三、实验内容提要1、用微量移液枪向灭菌的EP管中分别加入DNA 1ug和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2 u1， 再加入去离子水使总体积为19 u1将管内溶液混匀后加入1 u1酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底；5PCzVD7HxA2、混匀反应体系后，将EP管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37水浴保温2-3小时，使酶切反应完全，置于冰箱中保存备用；jLBHrnAILg3、制备琼脂糖凝胶并电泳（选择合适的DNA分子量标准作为酶切产物的大小对比），分析酶切产物的正确性并记录结果，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。xHAQX74J0X四、实验仪器设备微量移液器、微量EP管、加热块、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。五、 实验操作要点1、熟练掌握酶切体系的配置及注意事项。2、熟练掌握用DNA分子量标准标定酶切产物的大小。实验三 多聚酶链式反应（PCR）体外DNA扩增、产物回收及电泳分析一、 实验特点实验类型：验证 实验类别：专业基础 计划学时：8 每组人数：2二、实验目的1、了解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性及应用范围。2、熟悉PCR基因扩增的基本原理。3、掌握PCR基因扩增技术的具体操作过程。4、掌握DNA回收的基本原理和操作过程。三、实验内容提要1、在一个无菌的0.5ml EP离心管内加入PCR混合液50ul混匀（包括模板1ul、反映缓冲液5ul、F1引物1ul、R1引物1ul 、dNTP1ul、Tag聚合酶1ul、ddH2O401ul）；LDAYtRyKfE2、将Eppendorf离心管放入PCR仪反应仓中；3、设置PCR反应条件为：94变性5min后开始以下循环，94变性反应45sec；65退火反应45sec；72延伸反应1 min；进行30个循环；最后72反应7min；4 冷却恒定；Zzz6ZB2Ltk4、PCR产物分析：采用1.0琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性，根据标准DNA的大小粗略计算PCR产物的大小，记录结果，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。dvzfvkwMI15、按照试剂盒操作对PCR产物进行回收鉴定。四、实验仪器设备PCR仪、微量移液器、微量离心管、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。五、 实验操作要点1、 熟练掌握PCR反映体系的配置及注意事项。2、 掌握反映条件的设置依据及PCR仪的程序设置。3、 掌握PCR产物回收的基本操作过程。实验四 大肠杆菌感受态的制备及质粒DNA转化大肠杆菌一、 实验特点实验类型：综合 实验类别：专业基础 计划学时：8 每组人数：2二、实验目的1、了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2、掌握质粒DNA转化大肠杆菌的原理和方法。三、实验内容提要1、挑取大肠杆菌单菌落，接种于LB液体培养基中，37培养过夜；2、取500ul菌液加到50m1 LB液体培养基中，37振荡培养23hr，至OD600为0.30.5；rqyn14ZNXI3、冰浴2030min，8,500rpm 4离心5min收集菌体，用预冷的1m180mM CaCl2悬浮；EmxvxOtOco4、冰浴2030min，8,500rpm 4离心5min收集菌体，仍用预冷的200ul80mM CaC12悬浮，置于冰浴中备用(1224hr内转化效率最高)；SixE2yXPq55、加入1020ng质粒，混匀，冰浴30min；6、42热激90sec，冰浴2min；7、加入800ul LB液体培养基，37恢复培养1hr后，菌液涂于含相应抗生素的平板，37培养1016hr后观察结果，估计并计算感受态的转化效率。6ewMyirQFL四、实验仪器设备超净工作台、摇床、台式高速离心机、微量移液器、微量EP管、高压灭菌锅、水浴锅等。五、 实验操作要点1、掌握大肠杆菌感受态的制备过程及注意事项。2、掌握质粒DNA转化大肠杆菌的过程及注意事项。实验五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量一、 实验特点实验类型：综合 实验类别：专业基础 计划学时：8 每组人数：2二、实验目的1、掌握垂直板电泳的操作方法。2、掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理及鉴定方法，了解其应用。三、实验内容提要1、植物蛋白质提取方法：取100mg新鲜烟草叶片，加入液氮和石英砂，充分研磨；将粉末转入1.5ml离心管，待液氮完全挥发后，加入200ul（可根据量调节）蛋白提取buffer，振荡5min（可在振荡器上进行）；12500rpm，4离心20min，取上清，可-20保存备用。kavU42VRUs2、安装好电泳槽；3、制备分离胶8%（ddH2O4.7ml，30%/Acr/Bis2.7ml，1.5M TrisHCl（PH 8.8）2.5ml，10% SDS100ul，y6v3ALoS8910%APS50ul，TEMED5ul，Total10 ml），加入TEMED并混合均匀后，立即将分离胶倒入两块玻璃板之间，并马上在胶面上覆盖一层ddH2O，保持胶面水平，静置30min至胶完全凝固；M2ub6vSTnP4、制备浓缩胶：将上层ddH2O倒去，用滤纸吸干，制备浓缩胶4%（ddH2O3.1ml，30%/Acr/Bis0.65ml，0YujCfmUCw0.5M TrisHCl（PH 6.8）3.1ml，10% SDS100ul，10%APS30ul，TEMED5ul，Total5ml），加入TEMED混匀，立即将浓缩胶倒入两块玻璃板间，插上样品梳，静置30min至胶凝固；eUts8ZQVRd5、安装好电泳装置，取适量样品上样（样品需提前处理：样品：3Xloading buffer=2：1，混匀后，95煮5min，置冰上备用），加电压80V至溴酚蓝进入分离胶，加大电压至120V，电泳至溴酚蓝刚好跑出分离胶；sQ