第十三 十八章食品中有害物质的检测

第十三章 食品中有害物质的检测,第一节 概述第二节 食品中药物残留及其检测（食品中农药残留及其检测）第三节 食品中生物毒素及其检测（食品中霉菌毒素及其检测）第四节 食品中污染物的检测（食品中其他有害物质及其检测）,重 点 农药测定预处理方法。 有机氯、有机磷农残测定的主要方法。 有机磷和氨基甲酸酯类农残的快速检测法。 黄曲霉毒素B1的测定方法。,第一节 概述一、有害物质与有毒物质的概念在自然界所有的物质中, 当某物质或含有该物质的物料被按其原来的用途正常使用时, 若因该物质而导致人体生理机能、自然环境或生态平衡遭受破坏时, 则称该物质为有害物质。WHO定义有毒物质: 一般的定义为凡是以小剂量进入机体, 通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的物质。有毒物质是相对的。 剂量决定食品中有害物质：在正常食用含有该物质的食品时会对人体的组织器官或生理机能或精神造成任何急性、亚急性、慢性或者致畸、致癌危害的物质。,二、食品中有害物质的种类与来源食品中有害物质按性质分三大类： 是生物性有害物质, 如黄曲霉、口蹄疫致病菌等； 是化学性有害物质, 如DDT、氯丙醇、河豚毒素、重金属等； 是物理性有害物质, 如金属屑、石子、动物排泄物、放射性元素等。,内源性危害：食品中天然存在的有毒有害成 分，如河豚毒素、苦杏仁苷等；存在于食品中的生 理作用成分，如蛋白酶抑制剂；食物中的营养不平衡。 外源性危害：食品中的微生物污染，如经口传染的病菌、细菌毒素、霉菌毒素；人为掺假，有意加入的食品添加剂，如亚硝酸盐；意外或偶然进入食品的化学物质，如残留农药、重金属、多氯联苯。 诱发性危害：在食品加工、储藏过程中诱发食品内或生物体内生成有害物质，如油脂氧化产生过氧化物、亚硝酸盐与胺反应生成亚硝基化合物。,食品危害的来源：,三、加强食品中有害物质检测的必要性我国目前最常见的食品质量问题？,为什么要加强食品中有害物质的检测？,卫生指标超标,非法添加滥用食品添加剂,包装、标签不规范虚假标签、以次充好,保证消费者健康企业改进工艺、控制质量进出口贸易、国家地位与信誉,四、食品中有害物质常用的检测方法,薄层色谱法,气相色谱法,高效液相色谱法,色-质联用,酶联免疫法,第二节 食品中农药残留及其检测,杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、植物生长调节剂、杀鼠药,农药残留是指农药施用后，残存在生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢产物、降解物和杂质的总称。 残留的数量叫残留量。,农药残留是目前影响我国食品和农产品安全的主要因素，已经给我国农产品销售、出口和消费者的身体健康带来了严重影响。,对人体危害：通过食物和水的摄入、空气吸入和皮肤接触等途径对人体造成多方面的危害，如急、慢性中毒和致癌、致畸、致突变作用等；对环境危害：污染环境，破坏生态平衡。污染食品：使一些食品残留少量农药。,食品中农药残留的来源： 1. 施用农药对农作物的直接污染 2. 农作物从污染的环境中吸收农药 3. 通过食物链、生物富集污染食品 4. 其他来源的污染：事故性污染,农药进入人体的方式,土壤、水 、空气,家禽、畜,植物、饲料,水生动、植物,肉、蛋、乳,人,主要农药,有机氯杀虫剂有机磷杀虫剂拟除虫菊杀虫剂氨基甲酸酯杀虫剂,1.有机氯农药（Organochlorine pesticides, OCPs）主要有六六六粉(六氯环己烷)、DDT(二氯二苯三氯乙烷)毒性特点：难分解、半衰期10年以上，高残留；污染食品严重，脂溶性强，蓄积于脂肪和脂肪高的组织；中等毒性，致癌、致畸作用。性质：不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、乙醇、石油醚、环己烷，对光、热、酸稳定，对碱不稳定。,有多种异构体,较强杀虫作用,2.有机磷农药（OPPs） 是含有CP键或COP、CSP、CNP键的有机化合物。应用广。（1） 分类：高毒有机磷 （早期发展，现已被禁止使用） 如对硫磷（1605）、内吸磷（1059）、甲胺磷（3911）等；中等毒有机磷 如乐果、杀螟松、倍硫磷等；低毒有机磷 如敌百虫、马拉硫磷、双硫磷等。,一六0五,乐 果,甲胺磷,（2）特点化学性质不稳定，易分解，污染食品后残留时间短，在生物体不易蓄积。在加工处理过程（碾磨、洗涤、去皮、烹调）中可减少。以急性毒性为主，表现出神经中毒症状。长时间接触对肝脏功能有损。,过量或施用时期不当或使用高毒农药 是造成有机磷农药污染食品的主要原因,3.氨基甲酸酯类是一种高效、低毒、低残留的农药。通式：常见的有：甲萘威、呋喃丹、速灭威等。,甲萘威,4.拟除虫菊酯类 是模拟天然除虫菊酯化学结构而合成的农药。常用的有氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酯。 特点：高效、低毒、低残留，在环境中的降解以光解为主；对胆碱酯酶无抑制作用；亲脂性强，可溶于多种有机溶剂，在水中的溶解度小, 在酸性条件下稳定，在碱性条件下易分解。,食品中农药残留分析检测技术,1. 薄层色谱法（TLC）2. 气相色谱法（GC）占70%3. 气相色谱-质谱法（GC-MS）4. 液相色谱法（HPLC）5. 液相色谱-质谱法（LC-MS）6. 超临界流体色谱（SFC）7. 毛细管电泳（CE）8. 免疫分析（IA）,化学法、比色、分光光度法缺少特异性，灵敏度低,纸色谱、薄层色谱法,GC、HPLC,GC-MS、LC-MS定性定量、多残留检测,食品中有机氯农药残留量测定GB/T 5009.19GC-ECD法配标准混合使用液样品提取（用丙酮、己烷、乙醚、石油醚等）与净化（用H2SO4磺化）、浓缩（旋转蒸发或K-D减压浓缩）、GC分离检测（ECD检测器）。色谱柱用硬质玻璃柱，若用不锈钢柱，易引起农药分解。液体样品采样，应用玻璃瓶，不能用塑料瓶。 TLC法（2008年版本的取消了该法，均为GC，毛细管柱-填充柱-）,K-D浓缩器,固定相：1.5OV-17和2QF-1混合固定液的80-100目硅藻土,食品中有机磷农药残留量的测定 GB/T 5009.20-2003 原理：,果蔬中有机磷残留,提取,有机溶剂,净化,气化,注入GC,浓缩,色谱柱中分离,FPD检测,记录色谱峰,比较样品和标准品的色谱峰,外标定量（多用峰高）,样品处理,不同种类样品，处理方法有所不同。,色谱条件1色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长1.5m2.0m。 担体：60目80目美国Chromosorb W AW DMCS（酸洗二甲基二氯硅烷化白色担体）（1）分离测定敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷的色谱柱2.5SE30（甲基硅橡胶，极弱极性）和3QF1（三氟丙基甲基聚硅氧烷，中等极性）混合固定液1.5OV17（50%苯基-50%甲基聚硅氧烷，中等极性）和2QF1混合固定液（2）分离测定甲拌磷、稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷的色谱柱3PEGA（聚乙二醇己二酸酯，较强极性 ）和5QF1混合固定液2NPGA（己二酸新戊二醇聚酯，中等极性 ）和3QF1混合固定液2气流速度：载气为氮气80mL/min；空气50mL/min；氢气180mL/min（根据仪器选择各自的最佳比例条件）。3温度：进样口220；检测器240；柱温180，但测定敌敌畏（其稳定性差）为130。,测定进农药标液测峰高绘制标准曲线进等量试液测峰高计算,说明：国际上多用乙腈作为有机磷农药的提取剂及分配净化试剂，但其毒性较大，且较贵。,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类 农药残留量的快速检测 GB/T 5009.199-2003方法一 速测卡法（纸片法）实验原理： 胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。,实验试剂：1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片（速测卡）；2、pH 7.5 磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠Na2HPO412H2O与1.59g无水磷酸二氢钾KH2PO4，用500 mL蒸馏水溶解。实验步骤：1、整体测定法（1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g放入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上.(2) 取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。,（3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。2、表面测定法（1）擦去蔬菜表面泥土，滴23滴缓冲液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。（2）取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。（3）放置10 min以上进行预反应，有条件时在37恒温装置中放置10 min。预反应后的药片表面必须保持湿润。（4）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。,结果判断： 结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制（为阳性）、未抑制（阴性）表示。 与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。 对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。,注意事项及说明：1、速测卡灵敏度指标如下表所示。部分农药检出限参考表,2、速测卡符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。3、葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。,4、当温度条件低于37，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手指（体温）捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加得少、预反应后的药片表面不够湿润；二是温度太低。5、红色药片与白色药片叠合反应的时间以3min为准，3 min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐退去。,方法二 酶抑制率法（分光光度法）实验原理： 根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化硫代乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，就可以判断。,试剂：1、pH8.0缓冲液 11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL蒸馏水中。2、乙酰胆碱酯酶 根据酶活力用缓冲溶液溶解，3 min的吸光值变化A0值应控制在0.3以上。摇匀后在4冰箱中保存，保存期不超过4天。3、底物 25.0 mg碘化硫代乙酰胆碱，用3.0 mL缓冲溶液溶解，4冰箱保存。保存期不超过2周。4、显色剂 160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4冰箱保存。,分析步骤：1、样品处理 选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片。取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 mL缓冲液，振荡12 min，倒出提取液，静置35 min，待用。2、对照溶液测试 先于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂。摇匀后于37 放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1 mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值A0。 3、样品溶液测试 先于试管中加入2.5 mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3 min的吸光度的变化值At。,结果计算与判断： 表示样品中有高剂量的有机磷 或氨基甲酸酯类农药残留对检验结果阳性的样品需重复检验两次以上。,注意事项及说明1、对检验结果阳性的样品，需用其他方法进一步确定残留农药的种类和进行定量测定。2、酶抑制率法对部分农药的检出限为：,3、葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。4、当温度条件低于37，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试的吸光度变化A0 在0.3以上为准。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。酶的活性不够和温度太低都可能造成胆碱酯酶空白对照液3 min的吸光度A0变化值0.3。5、该法适用于大量蔬菜样本的筛检，不适用于最后的仲裁检测。,第三节 食品中霉菌毒素及其检测,食品中黄曲霉毒素B1的测定GB/T 5009.222003 黄曲霉毒素（AFT）是一组化学结构类似的化合物，根据其在365nm紫外光下呈现的荧光颜色可分为B、G两大类。根据Rf值不同，又分为B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中以AFTB1毒性、致癌性最强，且含量多。 常以B1为主要指标。 黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素。 AFT主要污染：花生、花生油、玉米、大米、乳制品、腌制鱼肉等，M1和M2主要存在于牛奶中。,性质：难溶于水，不溶于乙醚、石油醚及己烷。易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿、苯及乙腈等有机溶剂。对光、热、酸较稳定，对碱和氧化剂则不稳定。其纯品为无色结晶，紫外线对低浓度AFT有破坏性。,食品中AFTB1的允许量标准玉米、花生、花生油为20g/Kg玉米及花生制品（按原料折算）为20g/Kg大米、其他食用油为10g/Kg其他粮食、豆类、发酵食品、发酵酒、糕点、饼干、面包等为5g/Kg婴儿食品不得检出。,薄层层析法原 理 样品中黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。 该法最低检出量为0.0004g，检出限为5gKg。,仪器和试剂 (1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板5cm20cm、薄层板涂布器、展开槽(内25cm6cm4cm)、紫外光灯100一125w带波长365nm滤光片、微量注射器 (2)试剂 三氯甲烷、正己烷或石油醚(沸程3060或 6090)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。 硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。 黄曲霉毒素B1标准液：准确称取11.2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4保存。此标准液浓度约为10ugmL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度恰为10.0ugmL。在350nm，AFTB1在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19800。,黄曲霉毒素B1标准使用液： I液(1.0ugmL)：取1mL AFTB1标准液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。 液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 液(0.04ugmL)：取液1mI，按上法定容5mI。 次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO310H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸约25gL。污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。,分析步骤一、样品处理 取大样，经粗碎及连续多次用四分法缩减至0.5l kg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛，混匀。 二、提取 20.00g样品置于具塞锥形瓶中加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液振荡30min，静置，过滤于分液漏斗中分层后，放出下层甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内取20.00mL甲醇水溶液(相当于4.0g样品)置于另一分液漏斗中加20mL三氯甲烷，振摇、静置分层放出三氯甲烷层，经无水硫酸钠脱水，过滤于蒸发皿中5mL三氯甲烷重复提取，合并滤液于65水浴上挥干冰盒上冷却23min 1.00mL苯-乙腈溶解残渣转入小具塞试管中。,三、测定 单向展开法 a薄板制备：称取3g硅胶G，加23倍量的水，研磨12min呈糊状后，倒入涂布器推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在100活化2h，取出，放干燥器中保存。 b点样：在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。,滴加样式如下： 第一点：10L AFTB1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：20L样液。 第三点：20L样液+10L 0.04gmL AFTBl标液。 第四点：20L样液+10L 0.2gmL AFTB1标液。 c展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷(8+92)，展开1012cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：,1标液,2样液,4样液+标液,3样液+标液,第一点应有荧光，第一点滴加了AFTB1 0.4ng，作为最低检出量。如无荧光，则可能是薄层板未制好或色谱条件有问题。第一点有荧光，而其余三点无荧光，说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备。第一点有荧光，第二点无荧光，三、四点有荧光。说明样液不含AFTB1或含量小于最低检出量（5gkg）。四个点都有荧光。需做确证实验后再进行定量。由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0.4ng ，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性，则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标准为2ng，主要起定位作用，在上述色谱条件下，AFTB1的Rf值约在0.6左右。,d确证试验: 第一点：10L 0.04gmL AFTBl标准使用液。 第二点：20L样液 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40)，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：10L 0.04gmL AFTBl标准使用液。 第四点：20L样液。 按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。,e稀释定量： 若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：l0L AFTB1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：根据情况滴加10L样液。 第三点：根据情况滴加15L样液。 第四点：根据情况滴加20L样液。,f结果计算： 式中：X 一 样品中AFTBl的含量，gkg； V1一加入苯-乙腈混合液的体积，mL； V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL； D一样液的总稀释倍数； m加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004AFTBl的最低检出限量，g。,双向展开法（滴加两点法） (1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加AFTB1标液与样液。即在距左边缘0.81cm处各滴加10uL AFTB1(0.04ugmL)标准液，在距左边缘2.83cm处各滴加20uL样液。然后在第二块板的样液点上加滴l0uL AFTBl(0.04ugmL)标准液，在第三块板的样液点上加滴10uL AFTB1(0.2ugmL)标准液。,先 无水乙醚,后 丙酮三氯甲烷,标准,样液,样液+标准,样液+标准,(2)展开： a横向展开：10mL无水乙醚，展至板端后，取出挥干。根据情况，可再重复l2次。 b纵向展开：以丙酮-三氯甲烷(8+92)展开至1012cm为止。 (3)观察与评定结果： a在紫外灯下观察第一、二块板，若第二块板的第二点在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTBl含量5ugkg.,b若第一块板在与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，看第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，则第二块板可省略，直接做第三块。,(4)确认试验：另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘0.81cm处，各滴加10u LATTB1(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘2.83cm处，于第四板滴加20uL样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20uL样液、10uLAFTBl(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸，反应5min后，用热风吹2min(板上温度不高于40)。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中d做确认试验。,(5)稀释定量：(6) 结果计算： 同单向展开法。 注意事项 用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25gL)，浸泡消毒数小时后再清洗之！,酶联免疫(ELISA)法 enzyme-linked immunosorbent assay 实验原理： 采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。,仪器与试剂：（一）试剂盒组成1、AFTB1抗原包被96孔酶标板；2、抗体；3、酶标二抗；4、空白对照液；5、底物（1mg4）；6、底物液A；7、底物液B；8、终止液(2mol/LH2SO4)；9、PBS一T洗液；10、一次性手套（2副）。（二）仪器1、酶标仪； 2、离心机。,实验步骤：（一）样品中AFTB1的提取 1大米和小麦（脂肪含量3.0） 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中，65水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。,2. 玉米（脂肪含量3.05.0） 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL （相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65水浴通风挥干”起，依法操作。,3花生（脂肪含量15.045.0） 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇-水(5545）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇-水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65水浴通风挥干”起，依法操作。,4植物油 用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇-水(55 45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移入分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.525mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇-水溶液于75mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇-水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65水浴通风挥干”起，依法操作。,（二）样品测定1、将下列试剂稀释后备用PBS一T洗液：390mL蒸馏水稀释（1:40）；底物液A: 9mL蒸馏水稀释（1:9）；抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）；酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）；阴性对照液:200l抗体十200l空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。,2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液在玻璃试管内混合振荡后室温静置15分钟。启封酶标板，用洗液23分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔）,130l孔,37孵育（盖上覆膜），2小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液33分钟洗板，拍干。3、酶标记反应 加入酶标二抗，100l孔，37孵育1小时后，用洗液53分钟洗板，拍干。4、显色反应 lmg底物+2.5m1底物液A42l底物液B，待底物充分溶解后加入酶标板，100l孔，3715分钟后加终止液40l孔。5、测定 酶标仪490nm测定各孔OD值。,optical density,数据处理及计算结果：,标准竞争抑制曲线,薄层层析法(GB1法)和液相色谱法：可定性、定量，应用广，检测周期长,程序复杂,所需试剂繁多。免疫化学分析方法（如酶联免疫法(GB2法)、胶体金免疫层析试纸法）：快速,简便,特异,敏感,低耗，不需贵重仪器。适合大量样品的筛检及现场检测。受环境影响，可能会出现假阳假阴。,常见的动物性天然有害物质 1.动物肝脏中的毒素（胆酸） 2.河豚毒素 3.岩蛤毒素 4.螺类毒素 5.组胺常见的植物性天然毒素 1.氰苷 2.红细胞凝集素 3.龙葵碱 4.秋水仙碱 5.棉酚 6.毒蘑菇,第四节 食品中其他有害物质及其检测天然有害物质,表皮变成黑绿色马铃薯含有龙葵碱,发芽马铃薯芽眼处产生的龙葵素，可以引起人食物中毒,秋水仙碱,四季豆,消化酶抑制剂红细胞凝集素皂苷,胃肠炎型毒蕈中毒,毒红菇,食品加工过程中形成的有害物质：N-亚硝基化合物、多环芳烃和杂环胺。,组胺快速测定法 （约30min）薄层层析板-聚对苯二甲酸乙二醇酯取鱼汁直接点样展开剂-丙酮-氨水显色剂-茚三酮 紫色GB/T5009.45-2003 水产品卫生标准的分析方法 鱼体中的组胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。约34h,鲐鱼,食品中苯并(a)芘 食品中苯并(a)芘的测定方法：GB/T5009.27-2003 荧光分光光度法 试样经提取（如环己烷）、或经皂化后提取，净化后于乙酰化滤纸上层析分离苯并(a)芘，在波长365 nm的紫外灯下观察（蓝紫色荧光）斑点，剪下，用苯浸出，测定荧光强度。 目测比色法 同上，直接在滤纸上与标准斑点进行目测比色概略定量。,苯并(a)芘（多环芳烃 ）是烟熏食品、煎炸食品和焙烤食品中主要的毒素和致癌物。,乙酰化：引入乙酰基CH3CO- ，常用乙酸酐做乙酰化试剂。,盐酸克伦特罗的测定 动物性食品中克伦特罗残留量的测定： GB/T5009.192-2003 GC-MS HPLC ELISA,原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法GB/T22388-2008HPLC 试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。LC-MSGC-MS,SPE小柱,化学式：C3H6N6,甲醛次硫酸氢钠的测定甲醛的测定在磷酸酸性条件下对样品进行水蒸汽蒸馏，用水吸收，吸收液中的甲醛与乙酰丙酮及铵离子反应生成黄色物质，与标准比较定量。SO2的测定,应进行阴性样品对照（扣除甲醛和SO2本底值）,亚硝酸盐快速测定试剂盒，将试剂作成药片，显色后与标准色卡比较定量。食品中异物的检测方法金属探测仪法；X射线异物检测法；光学检测法等。,穿透力强，可检测食品中金属、玻璃、陶瓷、石块、骨头、塑料等硬质异物。,联线题： 发芽的马铃薯 哈喇味 汞中毒 龙葵碱 苯并(a)芘 盐酸克伦特罗 油脂酸败 “水俣病” 防腐剂 苯甲酸钠 瘦肉精 烟熏食品,第十八章 新资源食品的检测,一、新资源食品的定义在我国新研制、新发现、新引进的无食用习惯的，符合食品基本要求的物品称新资源食品。既然新资源食品不同于传统食品，是一种新兴事物，为保障人体健康，必须进行严格管理。 20