血清学鉴定实验

血清学实验,临床微生物学检验实验,医学检验技术教研室,血清学诊断：是指用已知细菌的特异性抗原检测患者血清中相应抗体的方法，以诊断感染性疾病。（用已知抗原检测血清中的特异性抗体）血清学鉴定：即采用含有已知特异性抗体的免疫血清（诊断血清）与分离培养出的未知纯种细菌或标本中的抗原进行血清学反应，以确定病原菌的种或型。（用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原）,微生物抗原成分-细菌抗原成分,菌体抗原:革兰氏阴性菌的菌体抗原称O抗原-脂多糖蛋白质的复合物,鞭毛抗原称为H抗原,表面抗原:不同细菌的表抗原名称不同.大肠杆菌的表面抗原称为封套抗原或K抗原,肺炎双球菌的叫荚膜抗原,伤寒沙门氏菌的表面抗原称为Vi抗原,细菌抗原,细菌的各种抗原,抗原抗体反应,抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应（erologicreaction）。,抗原抗体反应条件,抗原抗体,3.环境因素：（1）电介质：0.85%NaCI；（2）温度：37或56（3）pH值：7.0（4）振荡：适当的机械振（5）反应时间,抗原抗体反应的特点,特异性和交叉性若两种抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高。反应的可逆性抗原与抗体的结合为分子表面的结合，结合的适宜温度为040、pH在4.09.0范围内。如温度超过60或pH降到3.0以下，或加入解离剂台硫氰化钾、尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的抗原或抗体性质不改变。,抗原抗体反应特点,最适比和带现象只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称为带现象。抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出现的抑制现象称后带现象。为了克服带现象，在进行血清学试验时，需将抗原或抗体作适当稀释。,抗原抗体反应特点,反应的二阶段性结合阶段-反应发生快，几秒钟至几分钟。反应阶段-较慢，需几分钟、几十分钟或更长时间。,凝集反应,颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或吸附在乳胶、白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见的凝集小块。,凝集原凝集素,抗原抗体反应类型-凝集反应,血清学鉴定,掌握细菌的血清学鉴定法。,实验目的,实验原理,根据抗原抗体反应具有高度特异性的特点，用已知抗体来检测未知抗原（细菌）。,实验材料,1.菌种待检细菌2.试剂多价沙门菌O(A-F)诊断血清3.其他载玻片,沙门氏菌诊断血清（11种）,O抗原、H抗原和Vi抗原,O抗原:是一种沙门氏菌细胞壁表面的耐热多糖抗原，100，2.5h不被破坏，它的特异性依赖于细胞壁脂多糖侧链多糖的组成。H抗原:是一种蛋白质性鞭毛抗原，共有63种，60加热3060min及酒精作用均可破坏其抗原性，但能抵抗甲醛。Vi抗原:是一种N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，60加热1h即破坏其凝集性和免疫原性。,沙门氏菌的主要抗原组成,O抗原：至少58种,含相同抗原组分归为一组，引起人类疾病的沙门菌大多数在AF组。H抗原：分为、相，相以a、b、c等表示，相以1、2、3等表示。Vi抗原：抗原性弱，不稳定，可阻止O抗原与其相应抗体的凝集反应。,沙门氏菌菌型的表示方法,血清型以数字和字母表示.例如:查考夫曼-怀特沙门氏菌属抗原表.鼠伤寒沙门氏菌:O抗（1，4，5，12），第相H抗原（i）第相H抗原(1,2)。它的血清型应表示为:鼠伤寒沙门氏菌（1，4，5，12：i：1，2）内的O抗原可能存在或不存在。内的H抗原可能是罕见的，正常情况下一般不存在。,沙门氏菌的血清鉴定的方法,用O、H和Vi因子血清与待检的菌株作玻片凝聚试验。1.先用O因子血清确定菌株所属的O群及O抗原的各种成分。2.再用H因子血清检查其第1相和第2相的H抗原以确定血清型。3.必要时还要用Vi血清检查(目前有3种)。,1.先用AF多价O血清检查，确定菌株是否在AF六个O群的范围内。2.再用代表六个O群的O因子血清检查，即O2（A）、O4（B）、O7（C1）、O8（C2）、O9（D）、O3，10（E）、O11（F）。3.确定O群之后，分别用HA(a、b、c、d、i、z10、z29）HB、HC、HD四种多价H血清检查。4.用3.所确定的多价H血清所包括的所有H因子血清逐一检查定为第1相或第2相H抗原。5.检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原，或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，要用位相变异的方法再检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。6.综合O和H因子血清以及Vi因子血清的检查结果，按照考夫曼-怀特沙门氏菌属抗原表解判定沙门氏菌的菌型。,沙门氏菌的血清型鉴定步骤,实验方法,先用AF和Vi血清检测，根据结果再进行其他鉴定。,注意：,结果判断,沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表,注意事项,1.生理盐水端应不出现凝集颗粒。2.沙门菌Vi抗原存在时可阻止O抗原与相应抗体发生凝集，故在做玻片凝集时应加注意，需事先加热破坏Vi抗原，O抗原才得以与相应的O诊断血清发生凝集。,血清学实验进程,先鉴定AF和Vi，根据结果再进行其他鉴定。,沙门氏菌属常见菌型诊断抗原表,位相变异的解释,将一个双相沙门氏菌的菌株在琼脂平板上划线分离，所得的菌落中，有的有第1相H抗原，有的则有第2相H抗原。若任意挑取一个菌落在培养基上多次传代，其后代又可出现部分是第1相而另一部分是第2相的菌落。这种两个相的H抗原可以交相产生的现象称为位相变异。双相菌初次分离时，单个菌落的纯培养往往只有一个相H抗原，鉴别时常只能检出一个相，而测不出另一相。此时，可用已知相血清诱导的位相变异试验来获得未知的另一个相H抗原。,位相变异试验的方法,简易平板法1.配制0.70.8%的半固体琼脂培养基，然后倾注平板烘干表面水分。2.在平板内滴上一滴已知的第1相或第2相血清因子，并作好标记。3.待血清吸收到琼脂内，在标记部位的中间点种已知第1相或第2相的新鲜待检菌株。4.培养后，其已知相细菌的动力受到抑制，解离出另一相的细菌，并向周围蔓延生长，形成一个大的菌落