试验四-人毛囊DNA的快速提取及PCR检测性别M

实验四人毛囊DNA的快速提取及PCR方法检测SRY基因判断性别,实验目的,掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理掌握DNA的电泳检测技术学习PCR扩增DNA的原理，掌握PCR操作步骤掌握利用PCR技术扩增SRY基因判断性别的原理,试验内容,一毛囊DNA的快速提取与检测二PCR扩增进行性别鉴定,前期准备,前期处理：挑出毛发10根，尽量剪短至只剩下毛囊，去除毛根，放入干净的EP管中。加入PH8.0的灭菌水清洗1-2次，离心后吸出水,PCR扩增进行性别鉴定,PCR试验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术之一。,PCR扩增产物检测,用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶对PCR产物（DNA）进行电泳分离。琼脂糖凝胶中有很多小孔隙，起一个分子筛的作用，DNA在电场的作用下由负极往正极移动穿过这些孔隙，DNA迁移速率与电场强度成正比，与DNA分子量大小成反比。从而将大小不同的DNA片段分离开来。SRYPCR产物大小：501bpGAPDHPCR产物大小：565bp,PCR扩增体系,10ul总体系：H2O710=70Buffer1.010Primer-F0.33Primer-R0.33dNTP0.33Taq0.11Template(毛囊DNA)1.0ul,PCR扩增程序,95,4min;94,30s;60,30s;72,30s;Goto230循环72,5min;4,5min.,方法一酚仿抽提法,试剂：10%SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇TE10mmol/LTris-Hcl,PH=8.0;1mmol/LEDTA,PH=8.0步骤,酚仿抽提法,优缺点：该方法提取的DNA浓度不是很高，中间步骤过多会损失大量的DNA，所以如果是很细小的毛，并且量不多，不建议使用此方法。但是此方法提取的DNA质量较好，扩增效果好。,酚仿抽提法,图1.酚仿抽提法检测结果,方法二、碱裂解法,于装有毛囊的EP管中加入0.2mol/L的NaOH溶液50L，煮沸15min后，瞬时离心，吸取上清液至另外一只干净的离心管中加入PH=6左右的TrisHCl50L，13000r离心2min将上清液转移到另外一只EP管中即可。,方法二、碱裂解法,优缺点：该方法提取步骤较简单，提取周期短，并且DNA损失量较少，提取效率高。但PH值不容易调节以至于会影响到后续PCR扩增。因此如果PCR扩增效率不高的引物，不建议用该方法提取。,方法三、PCR扩增法,试剂：10PCR缓冲液、Mg2+、蛋白酶K(20mg/ml)实验步骤：按以下体系配制毛囊裂解液：10PCR缓冲液100LMg2+80L蛋白酶K(20mg/ml)1LddH2O819L,方法三、PCR扩增法,加入上述裂解液15L于放有毛囊的EP管中在PCR仪上设置一个单循环程序:6530min,9515min,410min。将上一步骤中的PCR试管放入预热好的PCR仪中,运行该程序；吸取上清液于干净的EP管中即可；,方法三、PCR扩增法,优缺点：该方法提取DNA的效率较高，可获得较多的DNA，并且需要的毛囊量较少。较细且少量的毛囊建议用此方法提取DNA。但是该方法抽提的DNA质量不是很好，扩增的时候需加大DNA加入量，并且扩增的结果中可能会有大量杂带。,图2：PCR法抽提检测结果,电泳检测,制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA具有结合EB分子的能力，在紫外灯下产生荧光的信号,二PCR扩增进行性别鉴定,性别鉴定原理人类男性的性染色体组成是XY，女性的性染色体组成是XX，因而通过对一些在Y染色体上所特有的基因（如SRY基因）进行PCR扩增分析，即可对性别进行鉴定。本试验通过对毛囊DNA中的SRY基因进行PCR扩增分析进行性别鉴定，扩增呈阳性的