第六章：常用分子生物学技术——RNA干扰技术.ppt

药学分子生物学,张徐江苏大学医学院分子生物学及检验教研室,xuzhang,生物芯片（biochip）,以生物、电子、机械和信息技术为基础，在固相支持物表面建立集成、连续、微型分析系统，形成芯片，实现对生物大分子的准确、快速、高通量、自动化检测。,基因芯片（genechip）,将大量探针有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探针，然后与标记的待测核酸样品进行杂交，通过对探针杂交信号强度的分析来获知样品中相应靶分子的数量和序列信息。,基因芯片工作原理：核酸分子杂交,1.芯片的制备,基因芯片检测步骤：,2.样品准备和标记,3.分子杂交,4.信号检测,5.数据处理分析,蛋白质芯片（proteinchip）,将蛋白质有序固定于载体上制备芯片，然后用标记的蛋白质或其他成分与芯片作用，洗去未结合的成分，再检测芯片上的荧光强度，来分析蛋白质间或蛋白质与其他分子之间的相互作用关系。,将不同生物体组织标本按预先设计的顺序排列在固相载体上形成的组织微阵列，是一种高通量、多样本的分析工具。,组织芯片（tissuemicroarray）,用人工方法测定并分析核酸的碱基组成及排列顺序，即测定核酸的一级结构。第一代测序技术：链末端终止法(Sanger法，双脱氧链终止法),核酸测序（sequencingofnucleicacids）,双脱氧链终止法测序,以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，在测序引物引导下，DNA聚合酶介导体外合成互补DNA。双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP）为链终止子（4组1套反应），合成四组有序列梯度的互补DNA。高分辨电泳分离新合成DNA，根据产物大小识读碱基排列顺序，最终转换为待测模板的核酸序列。,基本原理,双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP),测序模板序列,5TCAGCTCGAATC,第六章常用分子生物学技术,第一节聚合酶链反应第二节分子杂交技术第三节基因敲除技术第四节RNA干扰技术第五节基因组编辑技术第六节分子相互作用技术,RNA干扰技术,双链RNA能高效、特异性地诱导同源mRNA降解，从而沉默基因表达，称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi），也称转录后基因沉默。,1990年，在转基因牵牛花中观察到共抑制现象,RNA干扰（RNAinterference,RNAi）,1998年，AndrewFire和CraigMelo首次将正义链和反义链RNA混合后，注入线虫（C.elegans），观察到更强的基因表达抑制作用，据此提出RNA干扰的概念。,A.未染色组;B.正常对照组C.反义RNA组;D.正义+反义RNA组,2001年，首次报道在哺乳动物细胞中，通过21个核苷酸大小的siRNA诱导特异性基因沉默。,安德鲁菲尔&克雷格梅洛发现“RNA干扰机制”，获2006年诺贝尔医学奖,RNA干扰的机制,（1）siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）（2）RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成（3）RISC活化：siRNA解旋成为单链，无活性的RISC转变成活性形式（包含siRNA反义链）（4）诱导靶mRNA降解：在siRNA反义链引导下，RISC识别并切割与siRNA反义链互补的靶mRNA（5）dsRNA的再生成,RNA干扰的机制,siRNA（小干扰RNA）：21-23nt，由dsRNA裂解而成的小片段，可诱导mRNA降解。siRNA主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。,RNA干扰（RNAinterference,RNAi）,miRNA（微小RNA）：约22nt，由miRNA前体剪切而成，可抑制mRNA翻译。miRNA主要参与内源性基因表达调节。,RNA干扰技术实施策略,1、体外合成siRNA,采用化学合成法来直接合成靶向目的基因的siRNA，再通过不同方法导入细胞。,2、siRNA表达载体介导,根据siRNA序列设计DNA片段，插入表达载体中，导入细胞，转录出shRNA，进一步切割形成siRNA。,体外合成siRNA,短发卡RNA（shRNA）,siRNA表达载体介导,正义链,反义链,-CUGAGGUCACCAUUAGAUG-,靶mRNA,RNA干扰技术特点,1、RNA干扰技术优点,（1）具有较高特异性（2）基因沉默效率较高,2、RNA干扰技术缺点,“脱靶效应”（off-targeteffects）,RNA干扰技术的应用,2、基因治疗（基因失活性治疗）,（1）病毒感染性疾病通过RNAi抑制RNA病毒复制,1、基因功能研究（功能失活策略）,（2）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）siRNA药物,“基因敲减（knockdown）”,基因打靶（genetargeting）,利用同源重组原理对细胞特定内源基因进行改造的技术。,基因敲除（geneknockout）：宿主基因组中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，从而使靶基因失活。,基因敲入（geneknockin）：外源功能基因与宿主基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，从而在细胞内获得表达。,基因打靶（genetargeting）,基因敲除小鼠的产生,1.体外构建基因敲除载体：靶基因同源DNA序列+选择性标记基因,2.将基因敲除载体导入ES细胞：显微注射法、电穿孔法等,3.筛选、鉴定发生了同源重组的ES细胞：标记筛选法、分子鉴定法,4.将ES细胞导入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠的子宫,5.小鼠交配传代获得特定的纯合基因型子代小鼠,Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出现明显体重增加现象,REG基因敲除鼠（下图）出现脊椎弯曲等早衰现象,Gab1基因敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。,酪氨酸酶基因敲除后，本来是黑色的小猪，变成了白色，表现出典型的白化病特征。,基因编辑（geneediting）,对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。,CRISPR/Cas系统：由CRISPR基因座与其串联的Cas基因组成，通过序列特异的RNA介导，切割降解DNA。,Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/