实验6+DNA酶切、连接及电泳检测.ppt

实验结果分析,关于OD值分析,一个OD260nm单位相当于于50ug/ml双链DNA或40ug/ml单链DNA或RNAOD260/280:1.8-2.0DNA:1.8(RNA:2.0)比值2.0:RNA污染,质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA),质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图,关于电泳条带,质粒DNA的带型分析,M,pUC19,环形质粒DNA,超螺旋粒DNA,出现问题,电泳条带浓度和纯度电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固）质粒DNA的带型分析,实验六DNA的酶切、连接及电泳检测,实验步骤,（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）在200l的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：l）混匀；点动离心将反应液甩至管底。37(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。反应结束后，75，保温10min使酶失活。电泳检测,酶切,（二）DNA片段的连接(注：每人一管）取200l的离心管按下表加入试剂。混匀后点动离心，将溶液甩至管底置于已调好温度为12-16PCR仪中保温1-2h后取出电泳检测,连接,（三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测,琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7%（0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂糖凝胶（0.48g/40ml）。（注：全班制备4块胶）,1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。,实验目的,通过DNA重组技术构建DNA重组子,利用限制性核酸内切酶切割DNA+利用DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。,限制性内切酶的发现,1965年WernerArber第一个描述了限制性内切现象；HamiltonO.Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了其性质；DanielNathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。1978年这三人获得了当年的Nobel奖。,ArberW.SmithH.O.NathansD.,第一个DNA重组分子,1972年PaulBerg等人利用限制性内切酶EcoRI和连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工程的开始。,TheNobelPrizeinChemistry1980,PaulBerg,通过DNA重组技术构建DNA重组子,实验原理酶切,限制性内切酶（restrictionendonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。,生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。,根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为型、型和型三类。DNA重组技术中最常用的是型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。型切割位点则在下游24-26bp处。,命名,一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。,II型限制性内切酶主要特点：识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端和平头末端。,如:EcoRI的识别顺序为：5GAATTC33.CTTAAG5,回文结构的对称轴,限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37下反应60min,完全酶切1g的纯DNA所用的酶量。影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子,材料、试剂及器具,1、材料与试剂酶切反应：标准pUC19(2686bp)EcoR及其配套的酶切缓冲液检测：0.5TBE电泳缓冲液6电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖,2、器具：水平式电泳装置电泳仪,台式高速离心机恒温水浴锅（用PCR仪代理）微量移液枪微波炉或电炉紫外透射仪照相机及其附件,实验步骤,（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）在200l的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：l）混匀；点动离心将反应液甩至管底。37(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。反应结束后，75，保温10min使酶失活。电泳检测,（三）质粒酶切样品、DNA连接样品的电泳检测,琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7%（0.28g/40ml),（四）加样及电泳检测,1、酶切样品的检测酶切阴性对照（M1）：pUC19标样20l+6X的loadingbuffer4l酶切样品：pUC19酶切样品20l+6X的loadingbuffer3l,(1),DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。,实验原理连接,核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5-PO4末端与3-OH间形成3,5-磷酸二酯键。一个DNA片段的5-PO4末端与另一个3-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。,DNA连接酶作用机制,实验原理连接,酶,焦磷酸根,酶-焦磷酸根,酶,T4DNA连接酶作用机制：T4DNA连接酶作用分三步：(1)T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶AMP复合物。(2)酶AMP复合物结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。(3)产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.,常用的DNA连接酶是T4DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。T4DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。1Weiss单位是指在37下20min内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量。,T4DNA连接酶的最适反应温度为，为什么实验中采用14？1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定；2.连接反应时间长，低温下酶不容易失活,材料、试剂及器具,1、材料与试剂连接反应：DNA/EcoT14I:由11条DNA片段组成：19329、7743、6223bp、4254、3472、2690、1882、1489、925、421、74bpT4DNA连接酶及其配套的10连接缓冲液检测：0.5TBE电泳缓冲液6电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖,2、器具：水平式电泳装置电泳仪,台式高速离心机恒温水浴锅（用PCR仪代理）微量移液枪微波炉或电炉紫外透射仪照相机及其附件,（一）DNA片段的连接(注：每人一管）取200l的离心管按下表加入试剂。混匀后点动离心，将溶液甩至管底置于已调好温度为12-14PCR仪中保温1-2h后取出电泳检测,实验步骤,（二）DNA连接样品的电泳检测,琼脂糖凝胶的制备：制备2块1.2%琼脂糖凝胶（0.48g/40ml）。,（三）加样及电泳检测,连接样品检测：/EcoT14I样品5l（M2）DNA连接样品：20l恒压电泳:130V电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处，大约30-40分钟观察:紫外透射仪下观察电泳结果，并拍照记录。,实验预期结果,质粒及酶切样品电泳预期结果,从左至右：1./EcoT14IDNAMarker2.pUC19质粒3.pUC19质粒酶切样品,123,质粒不同构型的电泳行为,线型DNA,超螺旋DNA,123456,1：-EcoT14digest2,3：连接产物4：pUC19质粒5,6：酶切产物,酶切反应注意事项,酶量，反应时间及体积Oneunitofenzymeisdefinedasthequantityneededtocut1gofDNAin50ulinonehour反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。酶的使用：酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系中，用完后及时放回冰箱DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA,去污剂或过多盐离子等缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液，使用前应将缓冲液完全溶解并充分混匀。混匀：很重要，注意不可振荡反应温度：通常37终止反应：终止液，热失活，酚/氯仿抽提星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。,如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？,酶是否有活性2)模板性质是否清楚：酶切效果与DNA的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍3)模板纯度是否够4)甲基化程度对酶的活性是否有影响5)反应条件是否合适：温度，BSA,缓冲溶液，DTT6)酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，提前混合，动作要快一些，没有分装前的Mix，要求放在冰里，尽快使用,其它结果,限制酶切割后的DNA电泳得到的电泳条带有些扩散有蛋白质与DNA结合酶切条件不合适有外切核酸酶污染星号活性如果用限制酶切割DNA后得到的片段比预期的多限制酶的星号活性有其他限制酶污染测试DNA中有其他DNA污染,DNA片段的连接样品电泳预期结果,1：DNA/Eco14酶切片段2-3：DNA/Eco14酶切片段的连接产物,连接注意事项,反应液：应有ATP和Mg2+,而不要有高盐或EDTA，应使CIP,BAP或SAP完全失活，DNA应具5磷酸基团。DNA浓度：总DNA量应1-10ug/ml,否则太多DNA不能形成环状DNA。酶量和反应时间：根据产家定义来决定，一般160C过夜或250C/1h,1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成