转录组测序技术原理及应用

RNA测序技术原理及应用,遗传的中心法则,基因组转录组表观遗传组蛋白组层次,什么是转录组？,RNA是解读基因组的关键,RNA,Protein,Phenotype,Genotype,DNA,RNA测序技术,WorkflowofRNA-Seq,样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析,TotalRNA样品检测,Agilent2200检测OD260/280:1.82.2RNA28S:18S1.0;RIN7,新型安捷伦2200TapeStation系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。可扩展的通量16联或96孔微量滴定板快速得到结果平均每个样品只需一分钟便可获得结果使用简单可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程样品用量少每次运行仅需要不到2ul样品,检测报告-合格样品,棉铃虫/果蝇,检测报告-不合格样品,WorkflowofRNA-Seq,样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析,真核mRNA的纯化,mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。,链霉亲合素包被磁珠+生物素标记Oligo（dT）25+poly（A）,原核mRNA的纯化,AmbionMICROExpressKit,LNA扣锁型探针,mRNA反转录-fragment+RT,纯化过的mRNA样品加入1l的fragmentbuffer70作用1.5min。加入1l的stopbuffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc糖原无水乙醇）沉淀产物。RTdscDNA,末端修复(防止自连）cDNA3末端加AAdapter连接,第一天,消化DNA,mRNA的分离,mRNA的打断,cDNA的合成,第二天,末端修复,加接头,胶回收,3端加A,第三天,PCR,PCR胶回收,文库制备,文库质量检测：Aligent2100：片段大小、纯度、浓度qPCR：片段大小、浓度手工检测：跑胶验证。,WorkflowofRNA-Seq,样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析,HiSeq2500,ApplicationsofRNA-Seq,17,RNA-Seq(Transcriptome),WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome),生物信息学分析,RNA-Seq(Transcriptome),Characterizethetranscriptomeinunparalleleddetail,Technique2,20,RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly),RNA-Seq(Transcriptomeresequencing),RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly),文库构建,测序,组装,Denovoassembleatranscriptome组装流程,数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布）Unigene（transcript）功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框（CDS）Unigene表达差异分析（两个或两个以上样品）Unigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性分析,Denovoassemblytranscriptome信息分析主要内容：,Denovoassemblytranscriptome信息分析流程,Unigenes的GO注释,Pathway分析,RNA-Seq(Transcriptomeresequencing),cDNA文库构建,测序,比对到参考序列,Transcriptomeresequencing比对流程,比对统计基因表达注释基因差异表达分析基因结构优化可变剪接分析预测新转录本cSNP分析,Transcriptomeresequencing信息分析主要内容,Transcriptomeresequencing信息分析流程,应用-优化转录组注释信息,基因结构优化可变剪接鉴定基因融合鉴定RNA水平SNP分析,Genomicintergenicregion,Readscluster,PairedReadsdistribution,优化基因结构鉴定新的转录本,Paired-End(PE)Reads,Reads比对到参考序列基因间区域,鉴定可变剪接（AlternativeSplicing）,exon1,exon2,exon3,exon1,exon2,exon3,exon1,exon3,commonreads,junctionreads,mRNA,鉴定基因融合,分析RNA水平SNP,转录组重测序比对软件：SOAPDenovo转录组测序:组装软件：SoapDenovo比对软件：SoapSNP,36,转录组研究技术横向比较,转录组测序的优势,RNA测序与芯片检测基因数比较,RNA测序与芯片检测基因的表达量分布,GenomeRes2010,Case,实验材料收集：叶片，花序,果实,根时间点：0,4,8,12,16,20和24h将每个时间点采集的样品均匀混合测序策略：Illumina测序，1Gdata,1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought,抗逆相关可变剪接,外包膜蛋白16(AT2G28900),Intron-retention,Control,LowTemperatureResistance,低温胁迫相关的AS,低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来，揭示了可变剪接有重要功能。,AS调节机制,CCA1,生物钟相关基因，例如调节气孔的开关等,RNA-Seq单端测序（Quantification）等同于数字表达谱(DGE),WorkflowofRNA-Seq单端测序（Quantification）,生物信息学分析,RNA-Seq单端测序（Quantification）生物信息分析内容,测序数据评估筛选差异表达基因表达模式聚类分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作网络分析,RNA-Seq单端测序（Quantification）信息分析流程,RNA-Seq与基因芯片优缺点比较,case,PlantPhysiology2010,取样：选取在成熟季节开花后5,10,和15个星期葡萄分别代表葡萄果实成熟中的三个时期（postsetting,veraison和ripening）数据量：超过59Mreads数据，长度在36-44bp之间,运用RNA-Seq技术对葡萄果实发育过程中复杂转录特征的研究。,表二reads在基因组上的分布情况,表一测序数据,葡萄RNA-Seq单端测序,浆果发育三个阶段共有、特有基因表达分布图,基因表达量分布,表达簇的分类分布情况,差异表达的基因GO功能注释-分成了19个功能类群-按照基因在三个不同时期的表达趋势进行分类，分成8个cluster。