分子遗传学标志检测在白血病分型中的应用陈冰

分子遗传学标志检测在白血病分型中的应用,上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所陈 冰,白血病相关细胞-分子遗传学标志,Look AT. Science, 278: 1059,急性髓细胞白血病(AML)的细胞-分子遗传学标志,AML相关细胞-分子遗传学标志(1),AML相关细胞-分子遗传学标志(2),AML相关细胞-分子遗传学标志(3),AML相关细胞-分子遗传学标志(4),1185例不同亚型AML诊断和预后分子标志的分布,CBF白血病,M3,Shen et al. Blood, 188: 5593,Kaplan-Meier curves for OS and EFS according to genotypes with statistical significance in multivariate analysis. All AML patients without cytogenetic prognostic markers could be divided into three prognostic groups using four marker combinations: Low risk, bi-allelic CEBPAm+ and/or NPM1 m+/DNMT3Am-; High risk, DNMT3Am+ and/or MLLm+; Intermediate, all remaining cases.,605例无细胞遗传学预后标志的 AML患者预后分组,AML细胞-分子遗传学异常预后危险度分层国内专家共识,急性淋巴细胞白血病(ALL)的细胞-分子遗传学标志,Pui. N Engl J Med, 350: 1535,ALL相关染色体易位(1),ALL相关染色体易位(2),ALL相关染色体易位(3),(,1346例不同亚型ALL诊断和预后分子标志的分布,Chen et al. Leukemia, 26: 1608,Ph negative B-ALL中重要的预后相关分子标志,Mi et al. Leukemia, 26: 1507,IKZF1,CRLF2,分子遗传学检测技术在白血病诊断分型中的应用,核型分析,细胞遗传学基础,正常人类染色体分组,常见染色体异常数目异常,单倍体：n多倍体：3n或4n非整倍体：单体：monosomy三体：trisomy* 非整倍体：有丝分裂中染色体不分离或染色体丢失,常见染色体异常结构异常,缺失：deletion,重复：duplication,易位：translocation,等臂染色体：isochromosome,白血病细胞遗传学研究方法标本来源和采集,骨髓： 3-5ml ；*取自肿瘤组织本身外周血：(1) WBC10x109/L;(2) 原、幼细胞百分比10%*分裂相均来源于白血病细胞*无脂肪颗粒，标本质量好淋巴结：穿刺液或活检标本*骨髓浸润时可用骨髓标本,白血病细胞遗传学研究方法染色体制备方法,直接法：不经培养立即处理短期培养法：按1-3x106/ml细胞密度接种到培养基培养24-48h同步法：应用MTX或Fdu处理17h，使其同步化,白血病细胞遗传学研究方法染色体显带,Q带：荧光很快褪色，标本不易保存C带：染色体着丝粒显带，对染色体识别帮助不大G带：带纹细致，解象力强末端呈浅带，不利于该区异常的识别对分裂相数量及质量要求高，条件欠稳定R带：带型与Q、G带相反除Y染色体外，末端均呈深带，揭示该区的缺失与易位方法简便，重复性好，可成批显带对分裂相量少质差的肿瘤细胞显带成功率高带纹不如G带精细，难以识别微小异常,核型分析的优缺点,直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常为形态学检查，灵敏度有限必须有可分析的中期分裂相，无法分析间期核,荧光原位杂交（FISH）,染色体荧光原位杂交技术在肿瘤遗传学研究中的应用,FISH的基本原理：,单链DNA（探针）和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火杂交,单一序列基因探针（单标、双标）染色体着丝粒探针染色体涂色探针M-FISH,FISH探针的选用：,白血病的染色体异常：,染色体数目异常的检测染色体结构异常的检测 易位 倒位,FISH在白血病中的应用:,白血病的MICM诊断-常见染色体易位的检测鉴别标志染色体,发现、确定新的染色体易位，有助于定位克隆新的疾病基因白血病疗效判断,鉴定BMT后造血细胞的克隆起源白血病预后判断,检测微小残留病和监测早期复发,FISH正常信号,FISH融合信号（间期核）,单一基因探针单标记FISH inv (16) M4Eo,FISH探针的选用：,单一基因探针双标记FISHt (15;17)M3 (APL)t (8;21)M2b / M4t (9;22)CML,FISH探针的选用：,Chr 22 (BCR),Chr 9 (ABL),der 9 (ABL con BCR),der 22 (ABL con BCR),染色体着丝粒探针检测染色体数目异常染色体定位标记着丝粒及着丝粒周染色体易位,FISH探针的选用：,全染色体涂抹(Chromosome painting),FISH探针的选用：,FISH检测的优点（1）,直观，是细胞遗传学和分子生物学之间的桥梁敏感性和特异性高能分析一部分显带技术不易分辨的异常， 如某些倒位、丢失、复杂畸形等,FISH检测的优点（2）,与细胞形态学结合，有助于深入理解疾病的发病机制能检测石蜡固定和Rights染色标本多色FISH可在同一标本上同时检测多种序列。,FISH检测的优点（3）,间期核FISH：不需体外培养，对非分裂细胞即可快速检测可对终末分化的细胞进行检测在极短的时间内可检测大量细胞,FISH检测的缺点,染色体异常的检测受限于相应探针的获得对三体检测的敏感性高于对单体或缺失的检测标本的限制（骨髓、外周血标本优于实体瘤或石蜡包埋、冰冻切片标本）一次杂交只能检测1至数个异常，不能同时对整个基因组的染色体数目、结构异常进行检测,M-FISH （Multiplex-FISH）,特殊FISH探针的选用,Combinatorial M-FISHCOBRA M-FISH,M-FISH基本原理（1）,Combinatorial M-FISH,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YFITC X X X X X X X X X X XC y3 X X X X X X X X X XCy3.5 X X X X X X X X X X XC y5 X X X X X X X X X XCy7 X X X X X X X X X X,COBRA M-FISH,Chrom FITC TRITC 1 100 0 2 67 33 3 50 50 4 33 67 5 0 100,M-FISH基本原理（2）,46,XY,1q+,7q-,M-FISH的优点,一次实验可对整个基因组进行分析适于检测染色体数目异常及一些结构重排,M-FISH的缺点,无法分析倒位与微