基因芯片技术

基因芯片技术,Gene chips,芯片实验室（Lab-on-a-chip),微流体芯片（微流控芯片）（Microfluidic chip）,样品分离芯片,生物芯片（biochip),微阵列芯片： 基因芯片（ DNA芯片） 蛋白质芯片 组织芯片 细胞芯片 微流体芯片（微流控芯片） 生物样品制备芯片 核酸扩增芯片 毛细管电泳芯片,生物芯片的概念,生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质及其他生物组分的快速、高效、敏感地处理与分析。,生物芯片,分子生物学,统计学,计算机科学,化学,物理学,微电子学,Research Integration,二、基因芯片技术原理,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）,基因芯片技术的概念,由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为基因芯片技术,基因芯片的分类,原位合成芯片 （In situ synthetic GeneChip） Affymetrix公司,DNA微阵列 （DNA microarray） 斯坦福大学 Patrick Brown研究小组,合成DNA芯片,Affymex Inc.,显微光蚀刻,寡聚核苷酸合成,*,*,Synthetic Chips,ATCGTCCAGTACT.,密度大于1000/cm2,Affymetrix Inc.,原位合成芯片,DNA微阵列,DNA微集芯片,Stanford Univ.Patrick Brown,显微打印头,单链DNA/cDNA片段,Microarray Printing,DNA微集芯片,基本原理,DNA: double helix structure denaturation renaturation,基因芯片技术基本原理,基本原理：核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理大规模集成的固相杂交,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,基因芯片的制备与检测原理,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,Microarray fabricationSample preparationMolecular hybridizationDetection and analysis,1. 探针的设计与制备2. 支持物的选择与处理3. 芯片的制作 （1）原位合成芯片的制作 （2）DNA微阵列的制作,（一）芯片的制备,1. 探针的设计与制备,cDNA探针 100 + bp寡核苷酸（Oligo）探针 8 - 12 nt 20-30 nt 50-70 nt,2. 支持物的选择与处理,实性材料： 硅芯片、玻片和瓷片等膜性材料： 聚丙烯膜，尼龙膜，硝酸纤维素膜支持物的处理： 氨基化 醛基化,3.原位合成芯片的制备,显微光蚀刻技术压电打印法分子印章法,显微光蚀刻技术,4.DNA微阵列的制备,喷墨打印：非接触式针式打印：接触式,基因芯片制作的三种技术,芯片的制备,Gene probes（cDNA、DNA）,Ready-to-usemicroarray,or,arrayer,DNA芯片图解,Microarray:top view,Microarray:side view,ProbesAdhesion layerSubstrate,样品核酸的分离纯化 样品核酸的扩增、标记： 反转录标记 随机引物延伸标记 PCR标记,（二）样品的准备,Sample cells,Extract RNA or DNA2) RT or PCR amplification3) Fluorescent labeling,Reference cells,Sample ready,combine,Labeled RNA or DNA (Sample ),Labeled RNA or DNA (Reference),2),1),3),1),2),3),基因表达谱双色标记,样品的标记,标记方法： 反转录标记 随机引物延伸法 PCR,样品的标记,标记分子： 放射性同位素 生物素 荧光分子： Cy3、Cy5 FITC、TRITC,（三）分子杂交,1) hybridize,Apply sample,2) rinse,Hybridization,The labeled target is selectively bound to complementary probes Note: know the location of each probe on the array,x 12,000,传统杂交方法,手工,固定样品,标记探针,单个探针,费时、1-2周,费力、需同位素,不易自动化,基因芯片技术,可批量,固定探针,标记样品,大量探针,快速、平行化,易于自动化,荧光标记,基因芯片与传统杂交技术比较,（四）检测分析,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,芯片的扫描,图像处理,Detector 1,Detector 2,False-color differential image,图像分析,(1) find spots(2) quantitate spot intensities,图像分析,（3）calculate ratios,杂交结果的聚类分析,表达谱聚类分析软件 Treeview,基因芯片技术主要步骤,基因芯片技术的特点,高通量集成化微型化,三、基因芯片技术的应用,基因芯片技术应用原理,2.基因表达谱分析,基因突变检测及多态性分析,DNA序列分析,1.基因检测分析,基因芯片技术测序原理,BRCA1基因芯片与突变检测, G CA A A C G A G G C A A A A G T C C T T T G C T C A G T T T T C A T T T G C T C C G T T T T C A T T T G C T C G G T T T T C A T T T G C T C T G T T T T C A T T G C T C A G T T T T C A G T T G C T C A C T T T T C A G T T G C T C A A T T T T C A G T T G C T C A T T T T T C A G,靶分子,叠瓦式探针设计,BRCA1基因芯片与突变检测,样品 检测阳性 15例 14,对照 检测阳性 20例 0,WT,G/A杂合突变,A/A纯合突变,基因表达谱,gene expression profile基因表达mRNA的水平反应了在一定环境、一定细胞类型、一定细胞生长阶段和一定细胞状态下的基因功能信息。是对上述特定状态下哪些基因表达，表达水平如何，转录产物的结构形式如何等等信息的完整表述，包括每种组织细胞中的基因表达谱、细胞不同发育阶段的基因表达谱、正常和病理状态下的基因表达谱，治疗条件下的基因表达谱等等。,基因表达谱分析原理,肿瘤基因表达谱分析与肿瘤的分子分型,Molecular Classification of Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene Expression Monitoring Golub T R, Slonim D K, Tamayo P, et al. Science, 1999, 286, 531537,Molecular Classification of Cancer,leukemias : acute lymphoblastic leukemia (ALL) acute myeloid leukemia (AML) 38bone ma