虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析

虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析 摘要：骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，所以可以直接观察到分裂细胞。虎纹蛙分布在中国南方，骨髓细胞分裂旺盛。用秋水仙素处理后，可用于染色体标本的制备，也是染色体核型分析的好材料。染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行分析、比较、排序和编号。实验数据得到：第4、9对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm），其余为中部着丝粒染色体（m），没有亚端部着丝粒染色体（st），没有端部着丝粒染色体（t）。虎纹蛙染色体核型为K（2n=26）=22m+4sm。通过对虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备和核型分析可知，虎纹蛙的染色体条数为2n=26。关键词：染色体标本；核型分析；虎纹蛙；Photoshop软件引言：虎纹蛙是动物实验教学和研究的常用材料。虎纹蛙骨髓细胞具有染色体大，染色体数目少等优点。染色体核型分析（karyotype analysis）是将待测的细胞的染色体按照该生物固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组，并进行形态分析的过程。一般将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。用PHOTOSHOP软件进行分析。核型研究是人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动物起源、物种种间亲缘关系鉴定和远缘杂交等方面都有重大意义。1材料与方法1.1材料虎纹蛙 （中山大学细胞生物学实验室提供）1.2试剂Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），0.1%秋水仙素溶液，0.65%生理盐水，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4），Giemsa染液。1.3方法（1）实验前34h，按虎纹蛙每克体重24ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。（2）处死虎纹蛙后，立即取出股骨，用刀剔掉肌肉。（3）用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白位置。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min。（4）离心后，弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，低渗20min。（5）加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min离心10min后，弃上清液。（6）沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吹管吹打成细胞悬浮液，室温下固定20min。1000r/min离心10min后弃上清液。（7）重复步骤6的操作。（8）沉淀物中加入0.30.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。（9）用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上23滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。（10）将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液染色30min，自来水冲洗，空气干燥。（11）在显微镜下用低倍镜找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。并拍照。（12）用Photoshop对照片中的染色体进行剪切、分离、配对。先目测配对。（13）用Photoshop的测量工具，测量每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。（14）根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。（15）把染色体按照一定顺序一对一地排列，按照从大到小，短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列的规则排列，最后整成一张完整的染色体核型图。 2实验结果 实验所得的虎纹蛙染色体标本，在显微镜中显示染色体条数为2n=26下图为实验所得的虎纹蛙镜检照片图1实验所得虎纹蛙镜检照片实验所得的标本在显微镜下弯曲，轻微折叠。所以采用化生班郑雨涵同学的染色体图。用PHTOTOSHOP处理后，排列得到张染色体核型分析图： 图3虎纹蛙染色体核型分析图然后继续用PHOTOSHOP软件处理，测量每条染色体的长臂与短臂，并做出数据分析。分析表如下：染色体对数长臂短臂染色体长度相对长度（）臂指数着丝粒指数（）着丝粒位置138367314.901.0349.31m238.52563.512.961.5439.37m338236112.451.6537.70m43420.554.511.121.6637.5sm52319428.571.2145.23m61913326.531.4640.625m71711285.711.5539.28m81613295.911.2344.83m9158234.691.8834.78sm10156214.292.528.57m11139224.491.4440.91m12129214.291.3342.86m13128204.081.540m结果分析：1、 从上图数据可知：第4、9对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm），其余为中部着丝粒染色体（m），没有亚端部着丝粒染色体（st），没有端部着丝粒染色体（t）。虎纹蛙染色体核型为K（2n=26）=22m+4sm。2、 第7对染色体长臂出现了明显的次缢痕。这是虎纹蛙的一个染色体特征。但是没有发现端粒、随体等。3、 可推测第相对长度最短的第13对染色体为性染色体，且因两个染色体形状、大小相近，应为XX，与该青蛙为雌性的事实相符，但因为本实验并没有做成年雄性青蛙的对照实验，因此无法确定此结论。讨论1、 数蛙属两栖类的染色体组型中，染色体数都为26即13对，包括5对大型染色体及8对小型染色体，本实验的结果显示符合这一典型标准。2、 制作染色体标本过程中，低渗处理是实验成败的关键，其目的在于使细胞处于低渗溶液中从而涨大，染色体松散。处理时间太长会使细胞破裂，染色体过度分散或丢失。3、 秋水仙素的浓度和处理时间都对实验结果有很大影响。浓度过高，处理实验过长，都会使染色体过分收缩，不利于形态观察；浓度过低，处理时间过短，则收集到的中期分裂相少。4、 经典的核型分析方法是用显微摄像机将核型拍摄，洗出照片后用剪刀将各染色体剪下，然后分组、排序、粘贴、复拍，最后才制成核型分析的照片进行进一步的研究，方法繁琐且易出错。本实验采用photoshop抠图，测量，提高了准确度，但还是因为认为操作而造成误差。另外，由于一些染色体比相对较短，因此测量时的相对误差也较大参考文献1 王金发、何炎明. 细胞生物学实验教程. 北京：科学出版社，2004.9:83-85，91-93.2 王金发. 细胞生物学. 2003, 北京：科学出版社3邹佩贞. 广东韶关地区虎纹蛙、黑斑蛙染色体核型分析. 安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2008, 36(31): 13516- 13518.4杨大翔. 用Adobe Photoshop 进行核型分析. 5农业网络信息62005 年第3 期应用实践：44-46.The marrow cell chromosome preparation and karyotype analysis of frog (12Chemistry, Sun Yat-Sen university, Guangzhou, )Abstract: Specificity of the species in the karyotype that keeps relatively stable in the process of inheritance is a typical characteristic to identify kinds of species. The experiment use frog to be the study material. Then the relative length of every pair of the Chromosome is measured by photoshop and recorded to name and group them according to their brachial indexes and centromere indexes referri