免疫学基础与应用

免疫学基础及常用免疫检验技术,1,免疫学基础,3,项目介绍,2,免疫技术,免疫学基础,免疫学概念,免疫是机体识别自我物质和排除异己物质的生物学反应,是动物长期进化中所形成的一种生理功能。免疫学：研究机体自我识别和对抗原性异物排斥反应的一门科学。,抗原(antigen,Ag) 能诱导机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答中产生的抗体或效应细胞在体内外发生特异性反应的物质均称为抗原 抗体(antibody,Ab) 在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。,免疫系统 人体内存在一个负责免疫功能的完整的解剖体系即免疫系统，与神经和内分泌等其他系统一样，这个系统有着自身的运行机制并可以与其他系统相互配合，相互制约，共同维持机体在生命过程中总的生理平衡。,免疫系统的组成,免疫组织与器官 中枢器官（骨髓、胸腺） 外周免疫器官（淋巴结、脾脏、黏膜淋巴组织）免疫细胞 淋巴细胞（T、B、NK（自然杀伤细胞） 辅助细胞（吞噬细胞、树突状细胞（DC）免疫分子 免疫球蛋白、补体系统、细胞因子、黏附分子、CD抗原,免疫应答 指机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。免疫应答的过程 1、识别阶段 2、活化阶段 3、效应阶段,免疫系统的功能,免疫防御（immunological defence）: 机体排斥外源性抗原异物的能力免疫自稳（immunological homeostasis）: 机体识别和清除自身衰老残损组织、细胞的能力，是机体籍以维持正常内环境稳定的重要机制免疫监视（immunological surveillance）: 机体杀伤和清除异常突变细胞的能力，机体籍以监视和抑制恶性肿瘤在体内生长,机体免疫功能,免疫防御,自我稳定,免疫监视,正常免疫：防御病原微生物的侵害和中和其毒素异常免疫：反应过高引起变态反应，过低引起免疫缺陷病正常免疫：清除体内自然衰老或损伤的细胞异常免疫：识别紊乱造成自身免疫疾病正常免疫：清除复制错误或突变细胞异常免疫：功能失调时导致细胞癌变或持续性感染,免疫检验,免疫检验是研究免疫学技术在临床领域应用的一门科学。免疫检验分为两部分：利用免疫检测原理和技术检测免疫活性细胞、抗体、抗原、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质利用免疫检测原理与技术检测体液中的微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白等,免疫检测结果为临床确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了有效的实验依据。,临床免疫学,免疫性疾病 自身免疫性疾病、免疫缺陷病、免疫增殖病移植免疫 移植后保证移植物存活，不发生排斥 移植类型 HLA抗原肿瘤免疫 肿瘤标志物（诊断 治疗 流式细胞术）感染免疫 感染性疾病的诊断,颗粒性抗原的获得 1.细胞抗原（红细胞） 2.细菌抗原（菌体抗原、鞭毛抗原） 3.寄生虫体抗原,如何获取抗原（一）,可溶性抗原的获取 1.体液、分泌液（血清、血浆、尿液、精液、乳汁、唾液等） 2.组织细胞培养物等 利用机械破碎法（捣碎、研磨法）、反复冻融、超声法、酶法、表面活性剂 3.分子生物学技术制备抗原 分子克隆表达蛋白质,如何获取抗原（二）,抗体的制备（一）,多克隆抗体的制备 1.免疫动物的选择 常用家兔、绵羊、鼠、鸡、山羊、马 2.抗原接种 剂量、接种途径、间隔时间 3.采血提取抗体与纯化 4.抗体纯度鉴定,抗体的制备（二）,单克隆抗体的制备 利用杂交瘤技术筛选出杂交瘤细胞，具备永生化和能产生表位单一的抗体，将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔或进行细胞培养，可获得大量单克隆抗体。 基因工程抗体的制备 利用分子生物学技术人为进行抗体的构建,免疫检验技术,免疫检测技术的类型,酶免疫技术,酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性,主要试剂: 酶标记的抗体或抗原酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,酶免疫技术-分类,酶免疫测定(Enzyme immunoassay,EIA):用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量酶免疫组织化学技术：主要用于组织切片或其他标本中抗原的定位,酶免疫技术-酶联免疫吸附试验,酶联免疫吸附试验（ELISA） enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA,ELISA,1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。,抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。,基本原理,它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）,测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，,再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，特异性强。,ELISA的分类,（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA,（一）双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他未结合的物质,加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物,彻底洗涤未结合的 酶标抗体,加底物进行酶催化反应,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。,（二）间接法,包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体,加底物显色,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,（三）竞争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。,用已知特异性抗体包被固相载体,测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合,分别洗涤除去未结合的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量,酶免疫反应中的常用酶,1.辣根过氧化物酶（HRP）（最常用） horseradish peroxidase, HRP来源于辣根,易于提取，价廉，性稳定。2.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）3.-半乳糖苷酶,酶免疫反应中常用底物,1.HRP的底物辣根过氧化物酶催化的反应式：DH2+H2O2D+2H2O现在最常用的HRP底物： 四甲基联苯胺（TMB），TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，检测波长为450nm,ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎(甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体)、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。 也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物(甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等)。,酶免疫技术的应用,酶免疫技术的应用,生物素-亲合素放大技术在酶免测定的应用,生物素-亲和素系统（BAS） 生物素（biotin）、亲合素（avidin）是一对具有高度亲合力的物质，其结合稳定，具有多级放大效应将BAS与ELISA偶联起来，可大大提高ELISA测定的灵敏度，每个亲合素可结合4个生物素，可使反应明显放大。,荧光免疫技术,荧光免疫技术(immunofluorescence technique， IFT)将抗原抗体反应与荧光检测技术相结合而建立的一种标记免疫技术，具有高度的特异性、敏感性和直观性。,1. 荧光免疫测定技术的概念： 将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。,2. 分类： 荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法,3 .荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素 . 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 -荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 -化学发光技术,4 荧光素的荧光特性： 停止供能，荧光现象随即终止 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长发射光波长 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱,免疫检测常用的荧光素,1.异硫氰酸荧光素（FITC） 黄色或橙黄结晶，吸收收波长490-495nm，发射波长520-530nm，呈黄绿色荧光。2.四乙基罗丹明（RB200） 桔红色粉末，吸收max=570，发射波长595-600nm,呈桔红色荧光。3.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）4.藻红蛋白（PE） PE常与FITC合用于双色免疫荧光染色,三、荧光抗体技术： 抗原片的制作 试验类型 荧光显微镜检查,抗原片的制作,1 制作：临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。,2 标本的固定： 固定目的防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。易于保存。（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。, 常用的固定方法：抗原 固定剂 固定方法蛋白质 95%乙醇 室温310min或430min Ig类 甲醇 同上酶类 丙酮 同上激素 CCl4 同上类脂质 10%福尔马林