酶联免疫分析法

酶联免疫分析法,基本要求了解免疫分析法的分类，酶标记免疫分析法中使用的酶熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的酶联方法和试验方法，熟悉ELISA反应条件的选择，掌握ELISA的定量计算，了解ELISA的灵敏度提高途径，熟悉ELISA放大系统。了解化学发光酶联免疫分析,标记酶和发光增强剂，常用的生物发光反应体系。,酶联免疫分析法,第一节 酶联免疫分析概述第二节 光度酶联免疫分析第三节 发光酶联免疫分析,第一节 酶联免疫分析,一、免疫分析1、免疫分析发展史免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待测物质（抗原或抗体）与其相对应物质（抗体或抗原）之间专一特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。免疫分析主要基于用抗体（或抗原）作为选择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。,2、抗原、抗体与免疫反应抗原是能够引起免疫反应的分子。免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。免疫反应原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反应性的物质被称为半抗原（hapten）。,Ag+Ab Ag-Ab该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为 式中：k1为正反应速率常数；k2为负反应速率常数；K为反应平衡常数（亲和常数）。,基于抗原-抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原；定性或定量检测体内各种大分子物质；用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。,二、酶标记免疫分析法及常用标记酶1、免疫分析法分类,2、几种常用酶（1）对酶的要求纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强；具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；使用稳定性和保存稳定性好；测定酶活性的方法简便、灵敏、快速；待测体液中不存在与标记酶相同的酶；,待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生反应的干扰物质；酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉；均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原-酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。,（2）酶的评价指标 通常用RZ和酶的比活力评价标记酶的质量。RZ表示酶的纯度，以酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的比值。 HRPRZOD403nm /OD275nm 酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶或每1ml酶液所具有的酶活性单位数。HRP：RZ3活性 250u/mg，免疫学用；RZ2 活性 180u/mg，临床化学用；RZ1 活性 100u/mg，血糖试纸和尿液分析试纸用,酶联免疫分析常用酶,辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）提取自辣根中，相对分子质量为44kDa的糖蛋白。HRP的纯度以RZ值即A403nm/A275nm的值来衡量，高纯度HRP制剂的RZ3.0。通常以能在20、pH为6.0、20s的时间内催化底物邻苯三酚产生1mg红桔酚（purpurogallin）作为HRP酶的1个活性单位。用于标记的HRP比活性应大于250U/mg。,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。AP是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、磷酸核苷及6-磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐的同时产生有色的或荧光的产物。碱性磷酸酶的分子质量为80100kDa，最适pH为8.010.0，随酶源和底物的不同而变化。AP活性的测定以对硝基磷酸苯酯（PNP）作为底物。用作标记的AP比活力应大于1000U/mg。,葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）即-D-葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。它催化O2和-D-葡萄糖的反应形成H2O2和D-葡萄糖酸-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。反应最适pH范围为4.07.0，pH5.5时，反应速率最大。葡萄糖氧化酶对-D-葡萄糖的-异头碳有高度专一性。葡萄糖氧化酶的比活力至少为20U/mg。葡萄糖氧化酶在4下可稳定存在612个月。,-D-半乳糖苷酶（-D-galactosidase，Gal）即乳糖酶（-lactase），广泛存在于植物、动物器官、细菌、酵母和真菌中。当Gal催化水解-D-半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基转移到水分子受体，称为水解；若受体是糖或醇时，称为转半乳糖苷。Gal催化-D-半乳糖苷水解反应的最适pH为7.5，转化效率很高，且比HRP易于标记，背景值低，稳定性好。Gal比活力应不少于30U/mg，5能保存12年。,第二节 酶联免疫吸附分析法( enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA),一、ELISA分析1、原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； 在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体反应； 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例； 加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。,*Ag是酶标记抗原，Ag是未标记抗原，Ab是特异性抗体，(F)表示游离型的*Ag，(B)表示结合型的*Ag-Ab。,2、ELISA的固相载体良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。最常用的是聚苯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。ELISA载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。,3、固相载体的包被与封闭（1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液（或pH 7.2的磷酸盐缓冲液，pH 78的Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔，置4过夜，洗涤即可。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为0.120g/ml。,（2）封闭（blocking）指继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的ELISA固相载体均需封闭。常用封闭剂有0.05%0.5% BSA；10%小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（5%）。,4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1）稀释液常用中性PBS或Tris-HCl缓冲液，其中含有无关高浓度蛋白（如10动物血清、1BSA（牛血清白蛋白）、1明胶等）和非离子型表面活性剂（如0.05Tween 20或TritonX-100等）。（2）洗涤液一般与稀释液相同，常用PBS或Tris-HCl缓冲液。四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-2。,常用的抗体稀释液和洗涤液,（3）酶反应终止液 辣根过氧化物酶（HRP）反应终止液为2mol/L4mol/L H2SO4（HRP在酸性条件下丧失酶活性）。很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶，用3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。,5、ELISA法常用酶的底物系统ELISA法对底物的要求：价廉易得、安全；显色性和稳定性好；底物本身最好为无色物质；终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性；其最终产物可溶、易于测定及光吸收值高。,（1）辣根过氧化物酶的底物系统 常见底物有邻苯二胺（OPD，产物橙黄色，测定波长492nm）、5-氨基水杨酸（5-AS，产物橙色，测定波长550nm）、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB，产物红色，测定波长450nm）、2,2-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）等。ABTS的反应曲线不好。OPD溶液具有光敏性，相对来