免疫学诊断技术

免疫学诊断技术酶标，金标简介,目录,体外诊断试剂分类胶体金技术简介酶联免疫检测技术简介,一 体外诊断试剂 1.1 定义,体外诊断（IVD，In Vitro Diagnosis）试剂，包括可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用，在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，在人体之外通过对人体的样本（如血液、体液、组织等）进行检测而获取临床诊断信息的产品和服务，包括仪器、试剂、校准品、质控品等。原理是通过试剂和体内物质在体外的反应强度或速度来判断体内物质的性质和数量，通过和标准品的比较来判断人体的生理状态。,临床生化试剂： 用化学方法使样本产生变化，通过测吸光度，波长及颜色反应等进行疾病的诊断、治疗和监控，发展最早，最齐全，最大的一个版块；免疫诊断试剂：免疫生物学发展很快，利用抗原和抗体的特异性反应的原理进行疾病的诊断，在诊断试剂盒中品种最多；,1.2 体外诊断试剂的分类,分子诊断试剂： 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。分子诊断的材料包括DNA、RNA和蛋白质。PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，可广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等，填补了早期免疫检测窗口期的检测空白，为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶，综合了多种现代高精尖技术，被专家誉为诊断行业的终极产品。但其成本高、开发难度大，目前产品种类很少，只用于科研和药物筛选等用途。,功能检测试剂：血凝试剂，看凝血状态是否正常，常用于手术前或治疗心肌梗塞，血栓等，凝血时间缩短常见于血栓性疾病：如心肌梗死、不稳定型心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成、妊娠高血压综合征和肾病综合征等 ；凝血时间延长见于先天性凝血因子缺乏：如各型血友病等。其他：细胞染色切片，镜像等,免疫学诊断试剂的类型及应用,按方法分为间接免疫学试剂（如：protein-A不是很特异，易出假阳性）和直接免疫学试剂（如双抗体夹心法，双抗原夹心法，竞争法等）；按示踪剂分为放射免疫法，酶联免疫法，荧光法，化学发光法，胶体金法，乳胶法等；按照检测物分为：传染性疾病、激素、内分泌、肿瘤、药物检测、血型鉴定等等。,免疫层析胶体金技术是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式,该方法的核心技术是以条状纤维层析材料为固相,通过毛细管作用使样品溶液在层析材料上泳动,并同时使样品中经标记物标记的待测物与包被在层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生高特异、高亲和性的免疫。,二 胶体金技术简介,1 胶体金的制备,量取200ml超纯水，加热至沸腾，并保持微沸。,加入15ml1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟。,加入1%的氯金酸5ml,继续煮沸，待颜色有变化后计时，煮沸10min。停止搅拌，冷却至室温。,1.1 透射电镜下观察金颗粒的形状,劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大,胶体金颗粒带电情况基础金核双离子 内层负离子（AuC12） 外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中Zeta电位（又叫电动电位或电动电势，是表征胶体分散系稳定性的重要指标）可以使胶体金颗粒之间相互排斥，以维持胶体金的稳定状态。,1.2 胶体金粒径的大小与还原剂的量有关系,粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同。根据这一特点，可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。 1柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙 吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518 径粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15,2 胶体金标记技术的相关定义,免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。胶体金标记胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理一般认为是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、等非共价结合，免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。,胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。,胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.2molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.,附表：常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值,制备高质量胶体金的注意事项,（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45m）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。,3 胶体金技术的种类及优点,3.1 快速免疫金渗滤法 即穿流式的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体 。,斑点金免疫渗滤,双抗体夹心法测抗原,操作A ：加样，加金标记物；操作B洗涤，观察,3.2 免疫层析法 是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用局限性微孔滤膜的过滤性能不同，免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。,衬板,样品垫,金标垫,吸收垫,膜,胶体金免疫层析试纸条的构成,双抗体夹心法,标本,Gold,test,control,竞争法,标本,标准抗原,Gold,test,control,间接法,3.2.1 结果判定图示卡型,3.2.2 结果判定图示条型,3.2.3 结果判定说明,阳性结果：出现质控线和反应线两条紫红色线，实验结果为阳性。阴性结果：仅出现一条紫红色质控线，实验结果为阴性。无效：不出现质控线红线或仅出现一条反应线红线，实验结果为无效结果，应重试。竞争法的结果判定则相反,4 免疫胶体金技术的特点,优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定，干燥包装的试剂可在室温保存一年以上；无污染。单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。 成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT）中广为应用的方法。,不足： 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。,5 胶体金技术的应用,相关仪器 喷膜仪,仪器参数仪器尺寸为： 430mmx410mmX360mm平台大小: 450mmX70mm 平台移动速度: 0-330mm/sec X、Y、Z轴移动误差: 50um 定位精度: 10um in 1 axis;25um in 2 axis 喷点方式 BJQ3000: 非接触喷点AJQ3000: 非接触喷点 划线宽度 BJQ3000:0.50mm/line （喷点0.20mm/drop）AJQ3000: 0.5-5mm 最小喷量 BJQ3000:10nl/dropAJQ3000:1ul/cm 划线精密度BJQ3000:1%AJQ3000: 2%,切条机,仪器参数:进料宽度：100 mm进料长度：不限,可连续进料切割切割宽度：1 mm, 宽度连续可调切割宽度设定位数：0.01 mm切割精度：0.1 mm切割速度：230次/分钟, 速度连续可调切条计数：单次工作和总工作分别计数刀片: 日本进口, 耐磨高碳钢材料抗静电装置：建议选配电源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)330(W)260(H) mm,ELISA是一种免疫测定.基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,三 酶联免疫检测（ELISA)技术简介1. ELISA的原理,1.1 抗原抗体反应,1.1.1可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,1.1.2特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。蛋白上Y形的其中两个分叉顶端都有一被称为互补位（抗原结合位）的锁状结构，该结构仅针对一种特定的抗原表位。这就像一把钥匙只能开一把锁一样，使得一种抗体仅能和其中一种抗原相结合。,1.抗原结合区（Fab）2.抗原结晶区（Fc）3.蓝色的重链有一个可变区（VH），紧随其后的一个恒定区（CH1），一个枢纽区，以及另两个恒定区（CH2 and CH3）组成4. 绿色的轻链包含一个可变区（VL）以及一个恒定区（CL ）5. 抗原结合点6. 枢纽区,抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链（H链）；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（L链），链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子 。,1.1.3最适比例,1.1.4敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平；酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml；免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿；标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,2ELISA的类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。,2.1 双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,2.2 双抗体夹心法测抗原,反应原理和模式与双抗原夹心法类似。用特异性抗体进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗原。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗体代替酶标抗抗体。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,2.3 间接法测抗体,间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（二抗）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。,2.5 竞争法测抗体,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。,2.4 竞争法测抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,2.6 捕获法测抗体,IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。,3 ELISA的试剂制备,3.1包被的方式将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面,3.2 包被的条件,pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,3.3封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。,3.4 ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,4.1 加样:,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,4 基本操作注意事项,4.2 保温,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,保温方式：ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。,4.3 洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：,（1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。,（2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。,4.4 显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。,4.5 比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A