免疫沉淀类试验——双扩免疫比浊

沉淀反应,微生物与免疫教研室,沉淀反应（precipitation）,是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。,分类,液体内沉淀试验,絮状沉淀试验,环状沉淀试验,免疫浊度测定,凝胶内沉淀试验,免疫扩散,免疫电泳,单向免疫扩散试验,双向免疫扩散试验,火箭免疫电泳,对流免疫电泳,沉淀反应,沉淀反应的特点,抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖沉淀反应分两个阶段：第一阶段、抗原抗体特异性结合第二阶段、形成可见的免疫复合物,免疫浊度测定,经典的沉淀试验有4个缺点无法克服：操作繁琐敏感度低（10100g/ml）时间长难以自动化,（一）免疫浊度分析的基本原理：,抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量,（二）类型,透射免疫比浊法散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法,1 透射免疫比浊法,原理： 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。,方法评价：,优点： 灵敏度比单扩法高510倍； CV小于10； 操作简便快速，1h可报告结果； 结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。,缺点：抗体用量较大；检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；不宜用于药物等半抗原的测定；灵敏度较散射比浊法低。,2 散射免疫比浊法,原理： 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比浊法(endpoint nephelometry)。,3 免疫胶乳比浊法,原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。,（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b）结合后，则形成光线衰减,方法评价,敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。,总评价,缺点： 测定结果与仪器的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。,优点：自动化快速(3060s)灵敏(g/L)准确精密度高(CV5)稳定性好节省试剂检测范围广不需减去样本和试剂本底值等优点。,(三)、主要影响因素,抗原抗体比例抗体的质量抗原抗体反应的溶液增浊剂的使用,1 抗原抗体比例,高剂量钩状效应（high dose hook effect )海德堡（heidelberger）曲线理论,2 抗体的质量,（1）特异性高（2）效价高（3）亲和力高（4）抗血清来源,3 抗原抗体反应的溶液,pH 6.58.5电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）,4 增浊剂的使用,PEG、tween-20等非离子型亲水剂作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。,凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation),主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。,根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为2类：（一）免疫扩散 单向免疫扩散试验 (single gel diffusion test) 双向免疫扩散试验 (double gel diffusion test)（二）凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis),火箭免疫电泳,双扩散免疫电泳,一、单向免疫扩散试验,(一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,(二) 操作步骤（平板法）,1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56混合,即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3.置37,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。,单向辐射状免疫扩散上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右2为一异常病理血清,(三) 方法评价,单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L,(四) 影响因素,1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。 2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清为110IU/ml，羊为0.44IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。,3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。,二、双向琼脂扩散试验,(一) 原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。,(二) 操作步骤（平板法）,融化琼脂，浇板 每张载玻片约4ml。凝固，打孔 孔径3mm，孔间距35mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。加样 在相对孔内加抗原或抗体。孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。,(三) 双向免疫扩散试验的应用,1. 检测未知抗原或抗体及其相对含量 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中，见图 :根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率。,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D：扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab,2. 抗原性质分析,利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。,A1：待检抗原；A2：标准抗原,3. 抗体效价滴定,用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。,效价检测结果该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七天之后，颈动脉取血所得血清测定的效价。免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中可以看出最后测得的效价分别为： 1：256，1：128，1：128,中间孔抗原； 周围孔血清血清的稀释倍数分别为：孔11/8； 孔21/16； 孔31/32；孔41/64； 孔51/128； 孔61/256,6,5,4,3,2,1,4. 抗体或抗原纯度鉴定,用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出