第四章酶法解析.ppt

第四章酶分析法,酶分析法：酶活力测定（酶研究的一部分）酶法分析（酶作为分析的工具）前者的目的在于检知样品中某种酶的含量或活性，后者则主要用于测定与生物学有关的样品中酶以外其它物质的含量。两者检测对象不同，但原理基本一致：酶的专一性、高效性，通过酶反应速度测定物质的变化进行定量分析。,酶分析（EnzymeAssay）,以酶为分析对象，目的是检测食品、药物体液等生物样品中酶的含量或活性；如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活力测定等；,酶法分析（ENZYMEANALYSIS）酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。常用于食品、药物、体液等样品中成分含量检测如血糖、胆固醇等测定。,第一节、酶活力的测定,一、酶活力测定（一）基本定义,二、酶活力,（一）酶活力酶活力activity：酶催化一定化学反应的能力。用酶催化的反应速度来表示酶活力，即用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。转换频率：单位时间转化的底物分子数。Kcat,单位1/s,（二）酶活力单位及比活力酶活力单位U（activeunit）：是根据某种酶在最适条件下，单位时间内被酶作用的底物的减少量或产物的生成量来规定的，表示酶活力高低。IU：umol/minKat：mol/s1Kat=6107IU酶的比活力指每mg酶蛋白（或每mg蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活力=活力单位数/酶蛋白（氮）mg表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。,（二）测定方式有二：,1.测定一定时间内的化学反应的量通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶促反应产物的生成量。如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用比色法测定之。2.测定完成一定量反应所需的时间，测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。,测酶活力就是在确定的最适反应条件下测定酶促反应速度，酶促反应速度取决于那些因素？速度方程,测定酶活力的基本要求：1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）；所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作：底物？pH？温度？样品？,二、测定中应注意的问题1.初速度,底物浓度对酶速的影响,浓度选择：a）s=100Km；b）有时不宜采用高底物浓度（有毒性、价高、溶解度小、抑制酶反应等)则根据具体条件，通过实验选一适当浓度。,作用于待测酶产物的其它酶；（如腈水合酶与酰胺酶）其它因素。,空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发反应）引起的变化量空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预先使酶失效而测定例如：GPT测定中先不加底物；酸性磷酸酯酶中先不加酶；对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。,三酶活力的测定方法,（一）终止法是使酶促反应进行一定时间后，终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或底物变化的量。,三酶活力的测定方法,（二）动力学法是连续测定酶反应过程中底物、产物或辅酶的变化量，可以直接测定酶促反应的初速度。,三酶活力的测定方法,（三）酶偶联法指选择另一种酶与酶发生偶联反应，即第一种酶E1所催化的产物作为E2的底物，通过测定第二个酶促反应产物的量变化来测的活力，此法适用于活力不高或所催化产物不便测定的一些酶活力测定。,ABC,E1,E2,被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过NADH的特征变化而测知。,G+ATPG-6-P+ADP,HK,被测反应：,偶联指示反应：,G-6-P+NADPNADPH+6-PGCOOH（关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v是总反应系统中的限速因子，测得的指示反应速度和E1浓度间呈线性关系）,G6PDH,举例：-淀粉酶活力测定1.标准碘液法原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，消失的速率与酶活性有关。方法：终止法稀盐酸测吸光度2.DNS法-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。方法：终止法热变性测吸光度,第二节酶法分析,在进行酶法分析时，先要根据分析对象选择适它的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来检知它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法（终点法）外，其它都只能用动力学分析法。,条件：和酶活力测定的基本相同，但其所用的酶量必须一定，除了相应的被测因素的浓度应控制在限速水平以外，其它反应成份均须保证处于恒定和最适。,应用时应考虑两个问题，即工具酶的用量与反应的平衡点。,终点法要操作中应注意：(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反应；减少工具酶的用员。(2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。(3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。,（三）、酶法分析包括两个步骤：1.酶反应在适宜的条件下进行催化反应2.检测测定反应前后物质的变化情况，可以测定底物的减少、产物的增加或辅酶的变化,（四）酶法分析分类1.单酶反应定量使用单一酶与底物反应，然后测出物质前后变化，确定底物的量。2.偶联酶反应定量利用两种或以上酶的联合作用，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定被测物质的量。单酶反应的底物或产物不便用常规方法检测时。,三、酶标免疫分析法EnzymeImmunoassay(EIA)在70年代初，从放射免疫分析发展起来的一种称为“酶标免疫”的分析方法，它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能力有机地结合在一起，建立的一种高度特异、灵敏的分析方法。,放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度，这种分析方法称为放射免疫分析。,优点：,不需要特殊复杂的设备和仪器灵敏度高重复性好对健康无害,应用前景,食品卫生环境污染生化指标临床医学,“瘦肉精”快速检测新技术竞争酶标免疫法,“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的作用于肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的510倍时，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦肉精”。,当人们食用含有残留的肉品（特别是内脏）后常造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震颤，头晕，口干，失眠甚至瘫痪等中毒症状，重则引起人的死亡。色谱分析法一直是用作检测“瘦肉精”的方法，但是昂贵的设备及复杂的前处理工作不适用于基层的快速检测，而采用竞争酶标免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测（100个样品3个小时）。,海洋污染生化指标研究金属硫蛋白酶免疫法,原理：金属硫蛋白是一种能被重金属诱导的富含半胱氨酸的低分子量蛋白质。当环境存在着诸如汞、银、铅、镉等重金属时，便能诱导生物体内金属硫蛋白的合成，且在一定浓度范围内成正比。因此，海洋生物体内的金属硫蛋白可作为重金属污染的指标来研究。,试验内容：筛选了对镉敏感的底栖鱼类,并确定了镉诱导鱼金属硫蛋白的最适诱导条件。从镉诱导的鱼肝脏分离纯化金属硫蛋白并对某些性质（氨基酸组成、分子量、等电点等）进行研究。纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯化后并标记辣根过氧化酶，ELISA法测定金属硫蛋白。,非典型肺炎ELISA检测技术,酶联免疫吸附分析的特点是特异性强、反应灵敏、检出率高，是世界卫生组织(WHO)推荐的病原抗体临床检测的主要方法。,检测方法：,当人体被“非典”病毒感染并产生抗体之后，即用病人的血清(抗体)与检测试剂进行反应，呈阳性反应的说明受试者已受病毒感染。但对于发病早期还未产生抗体的病人，阴性结果也不能说明受试者未受病毒感染。仍需进行跟踪检测，如果超过“非典”潜伏期之后仍没有检测出抗体则可排除患病的可能。所以，在ELISA法中，有IgM，IgG两种抗体产生的患者即可确定为“非典”感染者。而对阴性结果仍需进行跟踪检测。,在对SARS这种高传染性疾病的斗争中，ELISA能够作出快速的检测，尽量缩短具传染性的病人与人群的接触。,综上所述，酶标免疫分析法具有广阔的应用前景，这需要我们去逐步开发！,酶标仪即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附试验的专用仪器。可简单地分为半自动和全自动2大类，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一个比色计,即用比色法来分析抗原或抗体的含量。ELISA测定一般要求测试液的最终体积在250ul以下，用一般光电比色计无法完成测试，因此对酶标仪