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遗传病的分析5DNA扩增产物的鉴定,限制性内切酶酶切技术琼脂糖凝胶电泳技术,一、限制性内切酶酶切技术,原理,限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链DNA分子中的特异序列（一般识别46个核苷酸序列）由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。,原理,本实验使用限制性内切酶（LweI），酶切位点：5.GCATC(N)533.CGTAG(N)9.5正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成2个片断；而病人组G则被A替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是个片断。,器材与试剂,高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等LweI限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等,操作,1、取样品2份（病人、正常人PCR扩增产物）无菌ddH2O14ul缓冲液102ul扩增产物3.5ul内切酶0.5ul2、置37oC水浴3h（或过夜）,20ul混匀,注意事项,内切酶需在20环境中保存。内切酶活性的发挥需要Mg2。为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。,二、琼脂糖凝胶电泳技术,原理,溴化乙啶（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA。EB用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCD摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB结合，在TAE介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，DNA分子会从负极向正极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。此时用紫外透射仪可以检测之。以标准Marker为参照物，可以得知被检DNA的大小。,器材与试剂,紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、移液枪、枪头、塑料离心管等1琼脂糖（含EB）、DNA样品、标准Marker、溴酚蓝溶液、TAE缓冲液等,操作,1、制备1%凝胶板：配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至50-60时，浇板；冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。2、制备上样样品3份（Marker、病人及正常人酶切产物）：每份样品在塑料薄膜上加：溴酚蓝溶液61ul样品ul3、点样：吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。4、电泳：接通电源（80mA），约30min。5、鉴定：取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。,混匀,结果,注意事项,溴化乙啶（EB）是强诱变剂，具有高致癌性！,定义：,
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