实验七、基因组DNA的制备

实验十、基因组DNA的提取,一、概述,染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交，同时在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。1、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色体DNA的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的4倍）。当用Cosmid构建文库时，片段长度应大于200kb;用噬菌体构建文库时应大于80kb。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成DNA断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段。2、Southern杂交：用于Southern杂交的染色体DNA片段长度要求可适当降低。3、PCRAFLPRFLP等：DNA片段长度要求可适当降低。,一、概述,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的DNA大分子。,二、植物基因组DNA提取(水稻和其它禾本科植物),1、试剂A.提取缓冲液：100mmol/LTrisCl（pH8.0）、20mmol/LEDTA、500mmol/LNaCl、1.5%SDS。B.氯仿/戊醇/乙醇溶液:80：4：16/氯仿：戊醇：乙醇C.异丙醇D.TE:10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).高压蒸气灭菌15分钟,储存于4冰箱。E.RNaseA：10mg/mlF.3mol/LNaAC,2、实验步骤,在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液，60水浴预热。水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60水浴保温30-60分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。室温下5000rpm离心5分钟。仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。在1.5mleppendorf管中加入1mlTE。用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。,2、实验步骤(续）,H.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。I.加入5ulRNaseA（10ug/ul），3710分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。J.加入1/10体积的3mol/LNaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。K.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。L.将DNA重新溶解于1mlTE中，-20贮存。M.取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时可取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。,3、注意事项,A、不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体DNA提取所用的提取缓冲液为：18.6g葡萄糖、6.9g二乙基二硫代碳酸钠（Sarkosyl）、6.0gPVP、240ul巯基乙醇、加水至300ml。B、DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。OD260/OD2801.8：说明较纯；OD260/OD2801.8：说明可能有RNA污染；OD260/OD2801.8：说明可能有蛋白质污染。C、DNA浓度：当OD260为1时，dsDNA含量为50ug/ml,ssDNA或RNA含量为40g/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml.dsDNA（g/ml）=50OD260稀释倍数,V-gene动/植物组织细胞基因组DNA小量纯化试剂盒,1、基本原理：该试剂盒采用公司自身研制的相分离技术和DNA制备膜选择性吸附DNA的原理从1-10mg新鲜动物组织或2-20mg新鲜植物组织中提取至多20ug纯净的染色体DNA.,2、实验步骤,样品收集：100mg新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入65水浴至样品粉末刚开始融化。加入700ulbufferG-L溶液和1.2ulRNaseA1贮存液，用力研磨30秒。转移650ul研磨好的匀浆至2ml离心管中，如体积不到650ul,加bufferG-L溶液至650ul,65下保温15min。加400ulbufferG-B溶液和1mlbufferDV(4预冷），用力混匀，12000g离心2min.去上相液体，保留间相和下相溶液。加入1mlbufferDV(4预冷），用力混匀，12000g离心2min.去上相液体，将下相溶液转移至Filter(置于2ml离心管中）。12000g离心30秒。,2、实验步骤,弃上相，在过滤液中加入400ulbufferDV,混合均匀。将DNAprepTube置于2ml离心管中，加入步骤7的样品。12000g离心30秒。弃滤液，将DNAprepTube置于原2ml离心管中,加入500ulWl溶液，12000g离心30秒。弃滤液，将DNAprepTube置于原2ml离心管中,加入700ulW2溶液，12000g离心30秒。弃滤液，将DNAprepTube置于原2ml离心管中,加入500ulW2溶液，12000g离心1min。将DNAprepTube管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加100-200l水或Eluent，室温静置lmin。最高速度离心lmin洗脱DNA。,三、细菌基因组DNA提取,1、试剂CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，缓慢加入10gCTAB,加水至100ml.氯仿：异戊醇（24：1）;苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）70%乙醇，TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml),5mol/LNaCl.RNaseA：10mg/ml,2、实验步骤：,5ml细菌培养过夜，12000rpm离心3分钟，去上清液。加567ulTE溶液悬浮沉淀，并加30ul10%SDS,3ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀，37水浴保温1小时。加100ul的5mol/LNaCl,混匀。加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65水浴保温10min.用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心3分钟。仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置10min,即出现絮状DNA沉淀。用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20。取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。,附注,如需降解RNA,则在步骤G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37保温30分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心10分钟。上清液至另一离心管中，加入1/10体积的3mol/LNaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。将DNA重新溶解于1mlTE中，-20贮存。,V-gene细菌基因组DNA小量制备试剂盒,实验步骤：样品收集：1ml细菌培养液5000rpm离心3分钟，用0.8ml细菌原生质体制备缓冲液悬浮沉淀，加20ul溶菌酶贮存液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25MEDTA,pH8.0,混合均匀，冰上放置5min。加0.3ml洗脱液，37保温5min.5000rpm离心5min.去上清，加0.1mlS-G溶液，彻底悬浮沉淀，冰浴5min.加0.45ml50预热的G-A溶液，用1ml枪头快速吸注10次；若太粘稠，则在45下保温5min,再用1ml枪头快速吸注10次。冰浴5min.加0.15mlG-C溶液，混匀，12000rpm离心1min.将样品加于微量滤器（置于2ml离心管中），12000rpm离心1min.,实验步骤（续）,吸取步骤中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1min，