HIV检测及临床意义.ppt

HIV检查及临床意义，中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室尚红，HIV的发现montgnie (las ) 1983.science 2203360868-871 Gallo (htlv ) 1983.science 2203360865-86 levy (ARV ) 1984.science225:840-8421986国际病毒分类委员会： HIV-21986西非中国每年新发现的HIV/AIDS病例数(19852002 )，HIV感染可通过两种方式检测： 直接检测病毒或其组成部分，有人体HIV免疫反应HIV特异抗体从感染转移到血清抗体阳的窗口期，平均13个月，部分HIV感染者发生延迟反应， HIV感染后抗原和抗体变化与疾病有关的HIV感染人体后出现一时性病毒血症，68周后血清抗体阳转，病毒滴度降低，随后58年无症状带毒期间一直存在HIV抗体，但无法发现病毒。 进入艾滋病期后血浆中病毒再次出现。 因此，诊断HIV感染的时间多用抗体检查来诊断，极早期(窗口期)用抗原检查来诊断。 HIV抗体诊断，目前临床上实际应用的是检测特异性HIV抗体，包括初筛和确认实验。 一、检测试剂、筛选试剂为HIV-1/2混合型，应经国家药品监督管理局注册认可，批量检测合格，临床评价质量优良，有效期内试剂。 目前常用的筛选试剂有酶免疫、颗粒聚集和其他快速诊断试剂。 采用供血机制进行血液筛查应采用酶免疫试剂。 自供血公司必须进行HIV抗体检测，艾滋病筛查实验室未建立的远程受训技术人员可以在规定场所快速试剂进行血液筛查。 2、确认试剂须经国家药品监督管理局注册批准。 确认试剂包括免疫印迹试验、带下免疫试验和免疫荧光试验试剂。 目前，免疫印迹剂是最常用的。 ELISA法：目前最常用的初筛实验，自1985年首次检测出HIV-1抗体的试剂盒上市以来，由第一代全病毒抗原间接法发展为第四代重组多肽抗原和抗P24抗体包复的夹心法，窗口时间缩短了23周。 第四代艾滋病酶联免疫试剂比较，第四代病毒降解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-P24Ab，IgM/IgG抗体HIV-1/-2/-Op24抗原，病毒降解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗体，closing the wie 第一代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG、IgM抗体，第四代试剂同时检测IgG、IgM抗体和p24抗原，缩短窗口时间。 检查结果报告和处理阴性反应发行HIV抗体阴性报告，最近有高危行为时，例如性骚扰、注射毒品等急性流感样症状时，为排除“窗口期”的可能性，可以进行HIV-1P24抗原和HIV核酸检查，或者23个月后进行抗体检查。 筛查实验呈阳性反应，可报告“等待HIV抗体检查”，不能报告阳性。 HIV抗体初筛检测流程图，快速诊断试剂：采用乳胶凝集、免疫斑点和免疫色谱三种原理，无特殊仪器灵敏度，特异性低于ELISA，且价格高的是血站不能复盖的边缘地区/城市大医院急诊手术前快速诊断阳性结果需要ELISA方法验证，HIV抗体确认，常用的确认实验方法为免疫印迹法(WB )。 免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。 一般用HIV-1/2混合型试剂测定，蛋白印迹实验(WB)中广泛使用的确认实验，是将聚丙烯酰胺凝胶电泳精制的HIV蛋白抗原分离后转移到硝酸纤维膜上。 检测体中存在的HIV抗体与条带上的抗原结合，加入酶结合的抗人IgG抗体和基质后，抗原抗体结合的部位出现有色条带，可以检测出检测体中HIV不同抗原的抗体，因此被用作确认试剂。不同的研究机构有不同的判定标准，WB结果判定标准为“不确定”():HIV-1特异条纹出现，但带型不足以确认阳性，每3个月随访一次，共计2次，判定为可疑、阴性，、或其中之一可以通过以下方法测定核酸：、免疫印迹法(HIV1/2混合型)、HIV-1阳性反应、可疑反应出现，需要HIV-2指纹带、HIV-1阳性报告、可疑反应、阳性反应、阴性反应、HIV-2血清学阳性反应报告时测定核酸，免疫印迹法(HIV-2 )、 随访3个月1次，共2次可疑阴性报告为随访期间出现阳性反应时阳性、阴性反应、阴性报告、P24抗原测定(1)适用范围、HIV-1抗体不确定或窗前期辅助诊断。 HIV-1阳性母亲分娩婴儿的鉴别诊断。 第四代HIV 1抗原/抗体ELISA试剂检测阳性反应，HIV 1抗体确诊为阴性者。 监测病程进展及抗病毒疗效。 (3)结果报告和说明，1，HIV-1P24抗原的阳性结果需要通过中和试验确认。 2、HIV-1P24抗原阳性只是作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此进行确诊。 3、HIV-1P24抗原阴性的结果显示，本试验没有反应，不能排除HIV感染。 辅助HIV核酸检查、1、某些不典型抗体反应的诊断，特别是反应不确定时，RNA的测定可以提供非常有用的证据。 仅凭RNA测定无法完全确定感染的有无，但RNA测定出现高拷贝数的阳性结果时(1000 )，暗示感染发生的可能性非常高。 应用该指标，综合分析和判断其他检测数据和样本的背景情况。 2、窗口期辅助诊断，窗口期抗原峰出现前后通常出现病毒载重峰，通常该峰高于发病时血浆病毒水平，早期病毒RNA测定具有特殊意义。 目前国际上通过该检测试验对供血样品混合多个样品进行RNA检测，以降低窗口传播的剩馀生命危险度。 3、病程监测、HIV感染发生后病毒承载量变化有一定规律，且该变化与疾病的发展密切相关。 通常，感染后无症状期间内发生的临床症状，很难与AIDS发病时的症状区别开来，病毒载量的测定，有助于医生判断刚发生的症状是否与HIV感染有关。 4、指导治疗方案和疗效测定，在任何情况下感染者都不应进行抗病毒治疗。 这不仅是经济原因，而且是抗病毒药物的副作用和疗效。 通常，在病毒装载量达到一定水平后(例如35000-50000复印/ml )才有良好的效果。 只有通过治疗后病毒水平的测定才能确定治疗是否有效，通常认为治疗后病毒水平下降50%在临床上是有效的。 监测病毒滴度反映疗效，5、预测病情恶化，HIV病情恶化与病毒载量关系非常密切，通过观察感染者病毒RNA水平可大致预测发病的可能性。 如右图所示，病毒载重量与6年发病率的关系为30000时80%。 定性检测、HIV核酸检测有定性和定量两种，定性检测用于辅助诊断HIV感染。 通常使用PCR和RT-PCR技术，在分子生物学实验室中使用共同的扩增试剂，引物可以从文献中或自行设计，尽量复盖全部或常见的毒株，也可以使用复合引物。 定量检测、定量检测常用于HIV感染者病程进展和抗病毒疗效监测。 目前常用的HIVRNA定量测定方法有逆转录PCR实验(RT-PCR )、核酸序列扩增实验(NASBA )、支链DNA杂交实验(bDNA )等，这些进口试剂盒的最低检测限制为20-50拷贝/ml，根据测定仪器的读数报告结果，使用试验方法、样品测量结果小于最低检测极限时，请注明最低检测极限水平。 注意低于最低检测限度的结果不能排除HIV感染。 必须附上机器印刷的数据。、各种HIV定量测定方法的比较、不同HIV定量测定方法的选择，目前，不同定量测定方法的标准品尚未出现不同定量测定方法的结果，不能直接比较同一患者的治疗前后，建议采用同一方法进行HIV定量测定，艾滋病免疫指标的测定，政府加快了国产抗艾滋病药物的上市艾滋病临床治疗中的各种免疫指标(CD4、CD8 T细胞等)在确定感染状态、预测发病、评价药物疗效和新药开发中有着重要作用。 CD4T淋巴细胞：(流式细胞术) CD4T细胞是HIV的主要靶细胞，随着感染后的进展，CD4T细胞有500/mm3临床诊断意义的200/mm3AIDSCDC进展，有AIDS诊断和疗效观察指标，HIV感染伴随的免疫应答能抑制急性症状，恢复CD4细胞的数量，但不能驱除病毒。 随着CD4细胞的下降，下降到500/ul左右，机会性感染和其他疾病开始出现，进入症状期。 CD4低于200/ul时，进入艾滋病期。 CD4 T淋巴细胞小于350/ul (结合病毒载重量决定治疗时间)，有效，HIV感染、病毒变异和耐药性的测定随着HAART治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株不断出现，而且对一种药物的耐药性是多种药物的交叉药物因此，近年来，各国相继建立了包括基因型HIV抗药性测试和表型HIV抗药性测试在内的病毒突变和抗药性测试方法。 表型HIV耐药性的测定方法可以直接测定HIV-1对药物的敏感度，明确预先存在或交叉的耐药情况，有助于指导HIV-1感染者的有效用药。 目前市售的试剂盒有av(vicroantivirography )和PS(VirologicPhenoSense )两种，两种方法都是从载体上生长的HIV-1得到的重组病毒和患者标本中应用蛋白酶和逆转录酶的序列该方法的最大优点是可以获得各种耐药测定数据，但不足之处在于试验慢，价格昂贵，技术要求高。 基因型HIV