细胞周期同步化

细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同细胞周期的时相，其中少数细胞发生有丝分裂活动，其馀细胞分别在G1、s和G2各期。 不同相的细胞对药物参与有不同的反应，影响实验的重复性，因此需要周期性地获得均匀的细胞。 细胞同步技术可以使细胞大量处于同一细胞时期，同时获得大量物质，如细胞中期的染色体。 细胞周期同步(synchronization )是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达和凋亡，通过某种自然或人为的实验手段，使细胞群中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相(G0期细胞除外)的现象。 细胞同步本质上包括以一定的方式获得一定数量的同步细胞群和将细胞融入同步生长两个意义。DNA合成抑制法是通过抑制DNA合成使细胞同时同步的方法。 高浓度TdR (胸腺嘧啶核苷)双重阻断法是抑制目前常用DNA合成的同步方法。 它可逆地抑制DNA合成，不影响其他时期的细胞运输，最终将细胞群阻断在s期或G1 /S的边界。 TdR是细胞DNA合成不可缺少的前体，但在培养基中加入过量的TdR，形成过量的三磷酸腺苷，后者可以反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，抑制DNA合成。 它使细胞与G1 /S期边界同步，同步程度高，适用于任何培养系统，大部分细胞都能同步，但容易发生不均衡生长，个体细胞体积增大。 TdR双重阻断法简单可逆，在肿瘤药理方面广泛应用于细胞周期同步化实验。 羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、糖苷、甲氨蝶呤和高浓度的ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，与DTR类似，可通过抑制DNA合成进行同步。中期阻断法是用破坏微管的药物将细胞阻断到m期，得到同期细胞的方法，常用的药物是秋水仙碱等。 秋水仙碱通过抑制微管的聚合，进一步抑制有丝分裂装置的形成，在有丝分裂中期阻断细胞后释放，使细胞同步化。 中期阻断法的非平衡生长问题尚不清楚，但可逆性较差，阻断时间过长会导致许多细胞异常分裂。 过去的研究也表明，同期细胞的生长能力不如去除阻断剂得到的s期细胞旺盛。 秋水仙碱、Nocodazole也是目前常用的中期阻滞剂。同步细胞可以通过流式细胞术分析其周期。 用PI (碘化吡啶)染液染色细胞，用流式细胞仪测定细胞内DNA的相对含量，可以分析细胞周期各时相的百分比。 细胞的DNA含量因时期不同而有显着性差异，可将细胞分为G1/G0期(1倍)、s期(1-2倍)和G2/M期(2倍)。 流式细胞仪可以通过DNA含量在不同时间内变化来确定细胞周期的长度，直接标记DNA复制(放射性同位素标记)，统计细胞数和标记细胞的比例，综合分析细胞周期。连续分裂的细胞从上次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束的全过程是细胞周期(cell cyc1e )。 细胞周期包括4个阶段：G1期(first gap )又称合成前期，是指上次有丝分裂到DNA复制为止的期间S期(synthesis phase )，即DNA合成期，是在真核细胞分裂(cell pision )之间进行DNA合成的阶段G2期(second gap ) 是DNA合成后期，DNA合成结束后到有丝分裂开始之间的一个阶段M期(mitosis or pision )也被称为d期，是染色体真正开始分离的时期。 细胞周期又分为有丝分裂期(m期)和分裂期(即G1SG2)两个时期。 细胞周期中各期的持续时间根据细胞种类而不同，但m期相对最短，s期较长。 流式细胞仪FCM )的结构是，在样品管中放入测定对象细胞，在气体的压力下，在充满鞘液的流动室中放入测定对象细胞。 在细胞流动室中，单细胞悬浮液被鞘流液包裹，通过流动室内一定孔径的孔形成细胞柱。 然后，通过逐一检测流动液体中的单列细胞，得到单一细胞的光散射和荧光指标，对其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理、化学特征等多个参数在功能水平上进行了定量分析。 流式细胞仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化决定细胞周期的长度，还可以直接用放射性同位素标记DNA复制，通过比较细胞数与各时相细胞的比例来测定是否达到目的，综合分析细胞周期的各时相。 流式细胞术与传统荧光镜检测相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。Hela细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，s期为7 h，G2期为3 h，m期为1 h。一、s期同步化方法(胸腺嘧啶双重阻断法，两次可使细胞同步化为G1/S期)。胸腺嘧啶核苷(TdR )双重阻断法：首次在对数生长的长期细胞培养基中加入过量的DNA合成抑制剂TdR，可逆转地抑制s期细胞的DNA生成，使许多细胞群与G1/S期边界同步， 还有部分细胞去除s期范围内的胸腺嘧啶核苷，细胞培养比s期长，比G2、m、G1三期合计短的时间，完全超过s期，周期发展最快的细胞不能进入下一个s期。 第2次的胸苷酸核苷处理，细胞持续运转到G1/S的边界时，被过剩的胸苷酸抑制而停止。 细胞聚集在G1/S期的边界，再次去除胸苷核苷，加入完整的培养基，使细胞持续生长，细胞同时在s期启动。 5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、糖苷、甲氨蝶呤、高浓度AdR和GdR等DNA合成抑制剂均可抑制DNA合成使细胞同步化，高浓度核苷对s期细胞毒性小，因此采用核苷双阻断法其优点是同步化程度高，适用于任何培养系统。 几乎可以使所有细胞同步，缺点是引起不均衡的生长，个体细胞体积增大。二、m期同步方法(振荡采集法)这个方法利用了m期细胞变圆容易脱落的特点。 在处于对数增殖期的单层壁细胞(分裂活跃，m期多)中加入Nocodazole。 不久，许多细胞与m期阻滞，轻轻摇动或敲打培养瓶，m期细胞离开瓶壁，漂浮在培养液中收集培养液，然后加入新鲜培养液，用这种方法继续收集，可以得到一定数量的m期细胞。 振动采集法操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，可真实反映细胞周期情况，缺点是m期短，分离的细胞少，仅适用于带壁细胞。 收集到的有丝分裂期细胞储藏在冰上，可以处理其馀的培养瓶。3 .实验用品1材料Hela细胞。2 .试剂：0.25%胰蛋白酶液，无血清细胞培养液，DAPI试剂，汉克s液，2mmol/L TdR，70%乙醇(4)，RNase-A(10mg/ml，20保存)，PI(650 g/ml，遮光-20)，PBS (pH 7.4保存)，秋水仙碱，秋水仙碱。3 .器材：培养瓶、移液管、枪口、5ml注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液管、Tips、烧杯、废液罐、细胞培养设备、跌倒显微镜、台式离心机、水浴、4冰箱、二氧化碳培养箱、N2罐、流式细胞仪、超净化台。4 .实验步骤(1)s同步同步方法(TdR双截止法)(一)采集指数生长细胞；(2)初次阻断：将对数生长期细胞的培养基置换为含2mmol/L的新鲜TdR培养液。(3)在37、5%CO二氧化碳培养箱中培养12小时(4)首次放出：丢弃含有核苷酸的培养基，用Hanks液洗涤壁细胞23次，换成不含TdR的新鲜培养基，持续培养16小时。(5)第二次阻断：放弃培养液，再加入浓度为2mmol/LTdR的新鲜培养基，在37、5%CO下培养12小时。(6)第二次释放：重复第(4)步骤，此时大部分细胞出现在G1/S期的边界，同步化细胞随着时间的推移逐渐进入s期。(2)m期同步方法(振荡采集法)(1)取出生长在占瓶底面积60%80%的细胞中的瓶，轻轻摇动或敲打培养瓶，使松弛的细胞脱落，浮游在培养液中，用离心管收集。(2)用汉克清洗2次，将冲洗液收集到离心管中。(3)以3) 600rpm离心5分钟，用培养液将细胞浓度调整为2.5105个/ml，接种到培养瓶中。(3)采用流式细胞术分析细胞周期时相；(1)将细胞继代培养至指数生长期，吸取细胞培养上清，用Hanks液洗涤细胞，用胰酶消化细胞，完全培养基，收集细胞。 1200rmp 5min离心，弃去上清。(2) 4预冷的PBS漂洗细胞沉淀2次，1500rmp离心5分钟，收集细胞。(3)早期将细胞悬浮液注入预冷的70%乙醇中，封口膜。 在4下固定夜晚(可延长至2周)。(4) 1500rmp离心5分钟去除固定液，收集固定细胞，0.4 ml PBS悬浮细胞，转移到试管均匀喷射(防止细胞破碎)。 PBS快两次。(5)细胞染色液制备： 40加成碘化吡啶(PI )母液(2 mg/ml):100RNA酶a母液(10 mg/ml):1PBS=25:10:1000 .(6)细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(11.5ml )悬空，使正常的细胞通过率为200350 Cell/s。(7)用300目(孔径4050 m )的屏幕过滤成流式细胞术，在机上测量。(八)样品分析测定及印刷。秋水仙碱抑制法(1)将细胞培养至指数生长期。(2)加入秋水仙碱，培养基最终浓度为0.250.5g/mL，作用67小时。(3)收集细胞，以800rpm离心510分钟，丢弃上清，沉入管底的细胞是m期细胞。(5)n2遮断法(1)将细胞继代培养至指数生长期。(2)将培养瓶放入N2罐中，流过适量的CO2(相当于罐体积的约5% )。(3)关闭n2容器，连接n2管道和压力计，向容器中缓慢填充氮气，直至压力达到8090磅/英寸。(4)将n 2装置放入37的培育箱中1016小时。 第二天取出，慢慢取出N2(最好取出窗外)。(5)取出细胞观察同步化效果，用振动法将细胞收集到离心管中。(6)以6)800rpm离心10分钟，收集细胞。(6)g1期和G2期细胞的获得1.G2期细胞的获得根据细胞周期测定的数值，采用胸腺嘧啶双重阻断法使细胞与G1/S期边界同步后，使细胞释放胸腺嘧啶双重阻断体后，继续培养。 其培养时间大于s期时间，小于s期和G2期的总时间。 之后，用振动收集法使进入m期的细胞从瓶壁脱落，丢弃上清培养基再用胰酶消化，加入新鲜培养基制作细胞悬浊液，离心收集细胞的是G2期细胞。2.G1期细胞的获得(1)在用胸苷核苷双重阻断法得到的细胞中加入一定量的培养基，持续培养比s2m期长的时间，就能得到G1期的细胞。(2)在细胞中加入缺少异亮氨酸的培养基进行培养，培养时间超过1个细胞周期，即可获得G1期细胞。moncommmamaliancellcyclesynchronization .Method模式同步索引代理ortreatment机构of actionCell cycle stage blockedchemical/pharmaacologicalinhibitionofdnareplication/synthesisormitticspindleformationLovastatininhibitionofhmg-coaredctase (cholestersynthesis )和the proteasomeEarly G1战斗机MimosineInhibition of thymidine，nucleotide biosynthesis，inhibitionofctf4/chromatianbindingLate G1； G1/SThymidineTdRexcessthymidine-inducedfeedbackinhibitionofdna复制G1/Saphiidicolininhibitionofdnapolymerase -anddnapolymerase -G1/SHydroxyureainhibitionofribonucleotideredctaseG1/SColchicineColcemideinhibitionofmicrotubeulepolymerizationG2/MNocodazoleinhibitionofmicrotubeulepolymer