肺癌患者的EGFR基因突变检测说明

i 肺癌患者的 EGFR 基因突变检测说明 第 1.0 版 2009年 3 月 6 日 第 1.5 版 2009 年 3 月 23 日 第 1.6 版 2009年 4 月 8 日 第 1.7 版 2009 年 5 月 11 日 日本肺癌学会 EGFR 说明编撰委员会 光富徹哉 谷田部恭 萩原弘一 弦间昭彦 西尾和人 秋田弘俊 中川和彦 目录 初版序言. ii 前言 . iii EGFR 的信号传导（图 1） . iii 小分子 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 . iv EGFR 基因突变 . iv EGFR 基因突变和 EGFR-TKI敏感性 . v EGFR-TKI的临床试验和 EGFR 基因突变 . vii EGFR 基因检测的种类及其特点 . viii EGFR 基因检测使用的临床样本及其处理 . x 医疗保险诊疗方面的注意事项 . xii 质量保证. xiii EGFR-TKI的其它效果预测因子 . xiii 结语实际诊疗和 EGFR突变 . xiv 文献 . xv ii 初版序言初版序言 表皮生长因子受体（EGFR：Epidermal Growth Factor Receptor）是一种跨膜受体酪氨酸激 酶，一般认为该酪氨酸激酶区域的激活即磷酸化对癌细胞增殖、生长的相关信号传递很重要。 基于这个观点，EGFR 作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注，并陆续开发出了 EGFR 酪氨酸 激酶抑制剂（EGFR-TKI）和抗 EGFR 抗体等。 2002 年 7 月，日本率先批准了 EGFR-TKI 制剂之一的吉非替尼（Gefitinib） ，2007 年 10 月，疗效相似的制剂埃罗替尼（Erlotinib）也通过审批。2009 年 4 月至今，使用 EGFR-TKI 制 剂治疗非小细胞肺癌的患者人数已超过 8 万 5 千人。在所经历的包括腺癌、非吸烟者在内显示 出神奇效果的病例中，EGFR 基因突变是最重要的科学性效果预测因子，这一点至少被包括日 本在内的亚洲国家所认识。在这样的背景下，2007 年 6 月 EGFR 基因突变检测被纳入了保险 条例，但是，并没有对本检测的实际情况进行分析说明。 在 2009 年 2 月 26 日召开的日本肺癌学会理事会会议上，光富徹哉理事提议编撰“肺癌患 者的 EGFR 基因突变检测说明” ，通过后，仅 1 个多月就完成了本说明。这也是以光富徹哉理 事为核心的 7 名 EGFR 说明编撰委员付出的巨大劳动成果，在此谨对他们表示深深的敬意和谢 意。本文不仅对 EGFR 基因突变检测进行了分析说明，而且还对 EGFR-TKI 的临床试验结果和 基础性的新知识及见解等进行了解读，希望对肺癌治疗医生以及更多的医疗相关工作者有所帮 助。 日本肺癌学会理事会 一濑幸人 iii 前言前言 吉非替尼（易瑞沙）是一种表皮生长因子受体（EGFR）的特异性酪氨酸激酶抑制剂 （TKI） ，在历经 5 年半的临床试验后于 2002 年夏被批准，2007 年末埃罗替尼（特罗凯）也通过 审批。这些药物常常给化疗失效患者带来神奇的临床治疗效果及病灶的改善。 2004 年春，发现了肺癌的 EGFR 基因突变，以此为契机 EGFR-TKI 的研发实现了跨越性的发 展 1,2） 。我们的理解虽说不能堪称完美，但我们认为 EGFR 基因突变的存在对使用 EHFR-TKI 受益 的患者的选择十分有用，尤其对我国的肺癌研究者来说，在这一观点上基本达成了共识。EGFR 基 因检测虽被纳入医疗保险，但有关该检测的实际情况是各地区、各医院、各主治医生分散地实施。 该指南以当今的知识和见解为基础对实际的检测进行了分析说明。 EGFR 的信的信号号传导传导（图（图 1） EGFR是HER家族的4个受体成员之一，由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3 以及HER4/erbB4四个分子构成。众所周知，HER家族的生长因子（配体）有11种，大致可以分为 与EGFR特异性结合的一组（EGF，TGF，双调蛋白（AR），与EGFR 和HER4结合的一组（ 细胞素（BTC），肝素结合EGF（HB-EGF），表皮调节素），与HER3、HER4结合的一组（神经 调节蛋白（NRG（别名heregulin）三类。虽然没有与HER2相对应的配体，但HER2通常会选择能使 之激活的类似配体结合，因此它极易与HER家族其它成员形成二聚体。 图1.EGFR通路。EGFR是一种跨越细胞膜的受体蛋白。酪氨酸激酶由N lobe和C lobe构成，ATP与两个lobe之间的cleft结 合。EGFR-TKI在这个部位与ATP竞争抑制。如果生长因子（配体）与受体结合，就会形成如图所示的非对称二聚体 （dimer），ATP 的磷被转移至调控区的酪氨酸残基上。各种蛋白与该磷酸化酪氨酸结合，下游蛋白不断地被激活，尤为重 要的是图中所示的RAS-RAF-MAPK通路和PI3K-AKT通路。 胞外区 1-620 跨膜区 620-685 调控区 953-1248 酪氨酸激酶 685-953 细胞增殖 细胞生存 配体 通路 通路 iv 另一方面，虽然HER3因氨基酸替换而丧失酪氨酸激酶活性，但是，作为活化磷脂酰肌醇3激酶 （Phosphatidylinositol3-kinase/PI3K）的二聚体，HER3仍保有PI3K的调节亚基p85的多个结合位点， 因此对与细胞凋亡有关的信号传导特别重要3,4 ）。 配体在胞外区结合后，EGFR分子间形成同二聚体，也可与其他HER家族分子结合形成异二聚 体。EGFR和HER4结合形成同二聚体的活性较低，形成异二聚体的活性则升高，尤其与HER2结合 的活性。之后胞内区的酪氨酸激酶（TK）被激活，酪氨酸残基相互磷酸化。于是各种接头蛋白 （PLC、aCBL、GRB2、SHC、p85）与该磷酸化部位特异性结合，并被传递到下游的RAS-MAPK 通路、PI3K-AKT通路、STAT通路等。从而导致了增殖、细胞凋亡逃逸、血管新生、转移等与癌细 胞相关的重要特征3,4 ）。在包括肺癌在内的各类肿瘤中，频繁发现EGFR基因的过度表达，而且还与 预后有关，因此EGFR作为分子靶标倍受瞩目。 小分子小分子 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂酪氨酸激酶抑制剂 最初的 EGFR-TKI 吉非替尼（易瑞沙）在日本于 2002 年夏被批准。当初，在以女性、非吸烟 者、腺癌为主的病例中发现了令人惊讶的肿瘤缩小效果。 吉非替尼是 EGFR 特异的可逆性酪氨酸激酶抑制剂，通过在 EGFR 酪氨酸激酶上与 ATP 竞争 结合，发挥其抑制作用。2007 年末被批准的埃罗替尼（特罗凯）也是 EGFR 特异的可逆性酪氨酸 激酶抑制剂。吉非替尼的最大耐受量（MTD）是 700mg/天，而在随机化二期临床试验中比较 250mg 和 500mg 时，发现 500mg 剂量组的不良事件率明显偏高，但因为二者的抗肿瘤效果相同， 所以以后推荐使用 250mg 剂量 5,6） 。另一方面，报告显示，埃罗替尼的 MTD 为 150mg，并被作为 推荐剂量使用，在使用这些剂量时，吉非替尼的谷值浓度为 0.4 M，与此相对埃罗替尼的谷值浓度 为 3.5 M7 ） 。关于皮疹和腹泻等不良事件，埃罗替尼的发生频率较高。 另一方面，吉非替尼被批准之后，产生的明显副作用是致死的急性肺损伤，这成为了最大的问 题。其发病频率为 46%，发病者的死亡率约为 30%8 ） 。令人不可思议的是，这种肺损伤不仅欧美 存在，亚洲的其他国家也存在，日本的问题最为严重。在台湾实施的小规模研究中，发病率为 5.8%9 ） 。在西日本胸部临床肿瘤研究机构（WJTOG）实施的 1976 例吉非替尼给药患者回顾性研究 中，不同临床背景的肺损伤发病率占全部病例的 3.5%，死亡率为 1.6%。不同临床背景的发病率如 下：男性为 5.8%，女性为 1.0%，非吸烟者为 0.8%，吸烟者为 6.2%，原有间质性肺炎为 13.9%，其 它为 3.8%8 ） 。另一方面，据阿斯利康（Astra Zeneca）公司实施的巢式病例对照研究（nested case- control study）显示，吉非替尼引起的肺损伤比普通化疗制剂的发生频率高，比值比约为 3 倍。吸烟 者、原有间质影的患者、PS 不良、正常肺占有率下降、55 岁以上、心血管系统并发症等虽然是危 险因子，但在吉非替尼中未能发现特有的危险因子 10） 。埃罗替尼的数据目前在收集当中，但特定使 用效果调查（所有病例调查）的中间分析结果显示，肺损伤的发生频率为 6.2%，1070 例中有 66 例，基本与吉非替尼相同。 EGFR 基因突变基因突变 众所周知，从二期临床试验阶段开始，EGFR-TKI 在女性、非吸烟者、腺癌、东方人中表现出 了优异的临床效果，EGFR 基因突变在这类肺癌患者中的发生频率较高，在以此前所报告的以 2880 例病例为对象的 13 项研究中，发现 EGFR 基因突变的频率与东方人（32%） 、 v 非东方人（7%） 、男性（10%） 、女性 （38%） 、非吸烟者（47%） 、吸烟者 （7%） 、腺癌（30%） 、非腺癌（2%） 等临床背景密切相关（图 2）11 ） 。据爱 知县癌症中心的研究显示，在组织类 型、性别、吸烟等临床背景中与 EGFR 基因突变独立相关的是组织类型和吸烟 状况 12） 。女性肺癌几乎都是非吸烟者腺 癌，因此，如果具备女性、非吸烟、腺 癌三个条件，突变频率可达到 63%左 右。一方面，男性吸烟者腺癌中突变频 率为 30%，女性吸烟者腺癌中为 50%， 如果吸烟者发生腺癌就有相当大的机率 存在 EGFR 基因突变。另一方面，男性 吸烟者非腺癌中 EGFR 基因突变频率极 低，132 例患者中只有 2 例。 图图 2. 不同临床背景下观察到的 EGFR 基因突变频率。 根据文献中 2880 例病例进行的统计 11） 。 EGFR 基因突变率虽然在腺癌中较高，但在未分化腺癌的大细胞癌病例和腺鳞癌 13） 、小细胞癌 14） （尤其是与腺癌的复合型）等病例中也经常检出 EGFR 基因突变*。从腺癌的各亚型来看，具有 细支气管肺泡癌（BAC）成分的腺癌15 ）在发现 TTF-1和表面活性物质的肺癌中发生频率较高16）。 虽然 EGFR 基因突变集中在细胞内的酪氨酸激酶区，但突变频率特别高的是外显子 19 的密码 子 746-750 为主要位点的缺失突变（48%）和外显子 21 的密码子 858 由亮氨酸变为精氨酸 （L858R）的点突变（43%） ，这两者占 90%以上 11） 。但是，在这种缺失突变中缺失氨基酸的个数 和伴随氨基酸替换等突变类型至少有 20 种，而据 Tanaka 等人统计，在 141 例外显子 19缺失突变的 日本人中，最多的是 E746-A750 单纯缺失，为 85 例，L747-E749 缺失合并 A750P 突变增加的为 12 例，L747-S752 缺失 合并 P753S 突变增加的为 11 例，L747-S752 单纯缺失为 5 例等 17） 。其次多的 是密码子 719 的点突变（G719X，氨基酸为 C、S、A 时均相同，全部表示为 X）和外显子 20 的插 入突变，分别在 34%左右。除此之外，还发现了少数罕见的点突变，也存在一些出现多种突变的 病例（图 3） 。 EGFR 基因突变和基因突变和 EGFR-TKI 敏感性敏感性 从总结的有关 EGFR 突变和 TKI 有效的 1335 例报告来看，在 EGFR 突变的 526 例肺癌患者中 TKI 有效的有 377 例（72%） ，另一方面，在未突变的 809 例肺癌患者中 TKI 有效的只有 80 例 *Toyooka等人的研究结果显示，11例腺鳞癌中EGFR基因突变率为3例（27%），其中1例为KRAS突变。另一方面， Tatematsu等人的小细胞癌研究结果显示，EGFR突变为5/122，但如果限定与腺癌的复合型，则为3/15（20%）。这些情况的 EGFR突变同样存在于鳞状细胞癌和小细胞癌的成分中，期待EGFR-KTI也能有效。 报告显示，在具有BAC成分的腺癌中EGFR突变率为50% 65%左右。此外，具有BAC成分的腺癌相当于野口分类的肺泡置 换型（A、B、C型），且EGFR突变率为40% 60%。 vi 图图 3. EGFR 基因突变的分布和不同基因突变的有效率 11）。 （10%）18 ） 。此外，很多 EGFR 突变的病例服用吉非替尼后的生存时间明显延长 19,20） 。最近，在日 本实施的针对 EGFR 基因突变阳性患者的 7 项前瞻性研究的荟萃分析 I-CAMP 中，全部 148 例病例 中有效率为 76.4%21 ） 。另一方面，没有 EGFR 基因突变的病例的 EGFR-TKI 有效率为10%18 ） ，我 们认为其中 EGFR 基因检测本身存在问题，将未能检测出的突变也加了进去，因此很难解释。在去 年发表的 IPASS 试验中（后述） ，突变阳性及阴性病例的有效率分别为 71.2%、1.1%。 EGFR-KTI 的有效性也因突变种类的不同而不同。外显子 19 缺失突变的有效率为 81%，与此 相对 L858R 的有效率为 71%，G719X 的有效率为 56%。值得特别注意的是 7 例外显子 20 的插入突 Yatabe 等人将具有任意一个 BAC 成分、TTF1 或表面活性物质（surfactant）表达的肺腺癌称为 TRU（terminal respiratory unit）型肺癌，并研究了其与 EGFR 突变的关系。根据 WHO 分类，这相当于众多非粘液型 BAC、众多乳头状腺癌、混合型 腺癌。195 例腺癌的 76%（149例）属于这种类型，其中 61%发生 EGFR突变。一方面，EGFR突变的 97 例腺癌中有 94%是 TRU型。另一方面，KRAS突变的 26 例腺癌中也有 15例为 TRU型。即 TRU肺癌包含 EGFR突变肺癌这一关系。 氨基酸一词的缩略语。A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸； I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸； T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；X，未知或其它氨基酸。 其它 EGFR基因 有效率（%） （N=327） 频率（N=569） L858R 插入突变 缺失突变 G719X 激酶区 vii 变病例中没有 EGFR-KTI 有效病例（图 3） 。 作为临床上的最大问题，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中 50%患者是 在缺失或 L858R 等的敏感性突变的基础上，又发生了第 790 位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变 （T790M） 。在 EGFR-TKI治疗前很少存在 T790M（13%22 ） ） ，这种情况下 TKI 难以有效。此外， 还报告了肺癌多发家族中存在的更为罕见的胚细胞变异病例 23） 。这证明了即使是单独的 T790M 也 能使小鼠发生肺癌 24） ，因此，T790M 突变不仅与吉非替尼耐药相关，还可能与致癌相关。 除此之外，还报告了 L747S25 ） 、D761Y26 ） 、T854A27 ）耐药突变，但不能认为发生频率非常低临 床意义就大。另外 50%患者中，其中大约一半患者的耐药性是由 MET 基因扩增引起的，其机理是 MET 基因扩增没有通过 EGFR 激活 ERBB3 信号传导通路 ，从而引起了对 EGFR 激酶抑制剂的耐药 性 28,29） 。将来，EGFR-TKI 抗药性出现时再进行基因检测，可以选择与其耐药机制相对应的治疗方 法。即在一个患者的各种临床情况中，掌握 EGFR 与相关基因的信息，以期进一步改善临床疗效。 EGFR-TKI 的临床试验和的临床试验和 EGFR 基因突变基因突变 在 EGFR-TKI 的三期临床对照试验中，延续了阴性的结果。首先，在观察 TKI 标准化学疗法的 附加效果以及延长生存效果的四个临床试验中，所有试验结果均表现为阴性 30-33）。在 TRIBUTE 试 验的部分病例中，也进行了 EGFR 基因分析，但我们认为 EGFR 突变是预后良好因子，而不是埃罗 替尼的效果预测因子 34）。其次，实施了吉非替尼（ISEL 试验35）或埃罗替尼（BR.21 试验）36） 和最佳支持治疗的对照试验，但只有 BR.21 试验显示出了 TKI 的生命延续效果。报告显示，在 BR.21 辅助分析中，EGFR 基因拷贝数是重要的效果预测因子，与突变无关 37）。此外，在 ISEL 试 验中拷贝数成为预测因子（无突变报告 38）。 最近的报告中，在与治疗恶化或复发的非小细胞肺癌二线以下的多西他赛的比较试验中，国内 的 V15-32 试验未能证明吉非替尼的非劣效性 39），国外的 INTEREST 试验能够证明其非劣效性 40）。在这些辅助分析的 INTEREST 中，吉非替尼 EGFR 突变阳性的无进展生存期（PFS）比化学疗 法长，但总生存时间（OS）无差异 41）。V15-32 试验中，所有 EGFR 突变患者的预后良好，单多西 他赛和吉非替尼无差异 42）。这些分析只是所有病例中极少部分的回顾性分析，而并不是最终的结 果，因此很难解释。 效果预测因子和预后因子。一般讨论癌症的生物标志物时，必须分析其标志物是预后因子（prognostic factor）还是（效 果）预测因子（predictive marker）。所谓预后因子，就是不影响治疗且与生存期有关的因子，而效果预测因子是实施特殊 治疗时与生存期有关的因子。需要利用某生物标志物进行治疗选择时其标志物是预测因子。在 EGFR-TKI 治疗的患者中， EGFR 基因突变患者的预后优于未突变的患者，此时，无法区别 EGFR 突变是预后因子还是预测因子。与实施化学疗法的 EGFR 突变患者相比，实施 EGFR-TKI 治疗的患者预后良好，有了这些信息才可以说是预测因子。实际上，根据未使用 EGFR-TKI 的肺癌切除后的预后分析，EGFR-TKI 突变阳性的患者至少在单因素分析中有预后良好的趋势。但是， EGFR 突 变与女性、非吸烟者这些陈旧的预后良好因子有混淆，只分析基因突变的意义几乎是不可能的。 viii 表表 1. 最近的吉非替尼临床试验与 EGFR 突变的关联 研究 设计 路线 有 EGFR 突变 无 EGFR 突变 PFS OS PFS OS G CTx G CTx G CTx G CTx Takano44 ） 回顾 性的 全部 - - 27.2 13.6 - - 13.2 10.4 观察性研究，无交叉 I-CAMP21 ） PII 1st 10.7 6.0 27.2 25.7 - - - - 非随机化，各种化学疗法，交叉 CTxG100%，GCTx？ INTEREST41 ） PIII 2nd 7.0 4.1 14.2 16.6 1.7 2.6 6.4 6.0 Global,G vs.多西他赛，交叉 CTxG37%，GCTx46% V15-3242 ） PIII 2nd 8 9 - - 3 3 - - 日本，G vs. 多西他赛，交叉 CTxG53%，GCTx60% IPASS45 ） PIII 1st 9.5 6.5 20 20 1.5 5.5 13 13 亚洲人，G vs 卡铂+紫杉醇，交叉化疗G39%，G化疗 49% ASCO2008 中 发 表 了 化 疗 后 依 次 使 用 不 同 剂 量 吉 非 替 尼 的 III 期 临 床 试 验 结 果 （WJTOG0203） 。吉非替尼并没有对所有病例都显示出显著的生存延长效果，但对腺癌病例表现出 了显著的生存延长，另一方面，非吸烟病例中的所有病例生存状态良好，但两组间无显著性差异。 吉非替尼组实际给予吉非替尼的病例只有 57%，化疗组有 51%，此外非吸烟化疗组中作为后期治疗 给予吉非替尼的病例为 76%，因此变成了难以解释的试验 43） 。 Takano 等人将国立癌症中心内接受治疗的肺癌患者分为 19992001 年和 20022004 年两组， 做了吉非替尼上市前后的回顾性分析。前者中仅有 15%接受了吉非替尼的给药，相对的后者中有 91%接受了给药。如果在 EGFR 有无突变的条件下分析，EGFR 突变阳性的 20022004 年组的 MST 为 27.2 个月，其它三组的 MST 均为一年左右 44） 。在前述 I-CAMP 中，作为一线治疗给予吉非 替尼的有 87 例，二线以后给予吉非替尼的有 61 例。于是，在比较一线治疗中的吉非替尼和化学疗 法之后，PFS 的中值为 10.7 个月比 6.0 个月，但 OS 无显著性差别（27.2 比 25.7 个月）21 ） 。这些虽 然不是 RCT，但是却明确指出了 EGFR 突变是疗效预测因子。 EGFR-TKI 并不是对所有肺癌患者都能表现出相同疗效的药物，因此我们认为有必要实施患者 选择的临床试验。在 2008 年的欧洲临床肿瘤学会（ESMO）上，发表了在亚洲实施的以轻度吸烟 或非吸烟腺癌患者为对象，卡铂+紫杉醇对吉非替尼的期临床试验 IPASS 的结果 45） 。该试验中， 在亚洲人、吸烟史、腺癌这三个临床背景下选择患者。在该项研究中，证明了吉非替尼 PFS 的优越 性。亚组分析中，在非吸烟者未发生 EGFR 突变的情况下，吉非替尼组的 PFS 明显比化学疗法组 短，作为 EGFR-TKI 的患者选择标志物，EGFR 突变明显比吸烟史更重要（EGFR 突变组、野生型 组的 HR 分别为 0.48、2.85）45 ） 。2009 年 3 月至今对 OS 一直处在观察当中，还没有得到最终结 论，但是现在无显著性差异。 上述结果总结如表 1 所示。这些数据表明，不应把 EGFR-TKI 作为所有非小细胞肺癌的治疗药 物，而是应该作为治疗有 EGFR 突变的肺癌的有效药物。西日本胸部肿瘤临床研究机构（WJOG） 及北东日本吉非替尼研究小组（NEJ Gefitinib Study Group） ，将 EGFR 基因突变的肺癌病例随机分 为吉非替尼组和标准化学疗法组，并进行了临床试验，正在等待试验结果。 EGFR 基因检测的种类及其特点基因检测的种类及其特点 直接测序（直接测序（Direct Sequencing）法）法 进行 DNA 合成反应时，正常掺入 DNA 链的合成原料 dATP、dGTP、dCTP、dTTP（总称 dNTP）会使 DNA 链延，如果掺入 dideoxyNTP（ddNTP） ，则会使 DNA 链延伸终止，利用该原理 可确定碱基序列（Sanger 法） 。现如今，荧光标记的使用已被自动化。通常在几个小时内可确定 300 个左右的碱基序列。虽然突变等位基因需要超过 20%且灵敏度不太好，但这是突变检测的基本 方法。委托 SRL公司利用本方法进行突变检测。 ix 然而，现今在临床样本的检查中已很少使用本方法。为了增加灵敏度、减少成本、缩短分析时 间、增加处理样本数等，开发了许多以 PCR 为基础的方法。下面简单分析一下这些方法。 可以筛选突变的方法（可以检测出未知的突变） PCR-SSCP 法法 该方法是利用不同单链 DNA 片段碱基序列特异性的高级构象不同而导致的电泳速度差异来检 测有无突变的方法。 片段片段（长度长度）分析）分析 利用 PCR 扩增目的片段，并利用基因分析仪检测 PCR 产物的长度。由于在外显子 19 缺失和外 显子 20 插入时会引起 DNA 长度变化，因此，如果是类似这样的突变，即便是未知突变也可以进行 筛选。 其他方法有 dHPLC（变性高效液相色谱法）、DGGE（变性梯度凝胶电泳法）等。 高灵敏度、快速进行特定突变检测的方法 EGFR 基因突变 90%是 L858R 或外显子 19 的缺失突变，因此可以集中检测特定突变。几个试 验可以同时检测多个突变。主要方法的分析说明如下。 PCR-RFLP（限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性）法）法 当含有突变的碱基产生特定的限制性内切酶识别位点时，利用电泳确认其是否被限制性内切酶 切断，从而检测突变。限制性内切酶识别位点也可以利用 PCR 引物人工建立。 假设只有极微量的突变等位基因时，利用电泳确认限制性内切酶是否能切断突变等位基因来检 测突变，进行 PCR-RFLP，之后设法将第二次的 PCR 产物突变特异性切断，这可以提高突变检测 的灵敏度。将这种方法称为突变体富集 PCR 法，并委托 AVSS 公司实施。 等位基因特异性等位基因特异性 PCR 法（法（ARMS 扩增扩增阻滞阻滞突变系统突变系统） 该方法是利用突变的碱基设计在引物 3端的引物，通过进行特异性扩增突变 DNA，检测有无 突变的一种方法。通常的办法是错配多个碱基来增加特异性。 PNA LNA PCR-Clamp 法法 该方法是一种将利用 PNA（肽核酸）阻碍正常序列的钳引物（clamp primer） 、LNA（锁核 酸）作为检测探针使用的实时 PCR。如果 PNA和 LNA 错配 1 个碱基，就会大大降低 Tm值，因此 与普通的 DNA 探针相比，特异性也有所提高，可以进行高灵敏度测定。委托三菱化学美迪恩斯株 式会社利用本方法进行突变检测。灵敏度 1%左右。 PCR-Invader 法法 在 PCR 之后实施 Invader 法。如果酶将 2 种探针和样本 DNA（PCR 扩增产物）形成 3 条链的 部位切断，则会产生荧光信号，特别是单碱基突变。与仅依靠探针结合的实时 PCR 相比，特异性 非常高。可以进行高灵敏度测定。委托 BML公司利用本方法进行突变检测。灵敏度 1%左右。 Scorpion ARMS 法法 该方法是利用与荧光探针相连的蝎状引物（Scorpion）进行的实时 PCR。通过将与探针部的突 变部位结合的邻近碱基（第 2 个碱基）与错配的碱基替换，并与阻断延伸反应的“ARMS”技术结 合，提高特异性，从而可以进行高灵敏度测定。国内的罗氏诊断有限公司销售全套试验器材，目 前，正准备委托检测中心利用该方法进行突变检测。灵敏度 1%左右。 Cycleave 法法 该方法是检测点突变的一种方法。设计突变特异性探针，并将两端用荧光色素和淬灭物质标记 x 好。突变特异性碱基以 RNA 为模板合成，如果该碱基与 PCR 产物杂交，则由于所加入的 RNaseH 是在 DNA-RNA杂交的 RNA部分切断探针的一种酶，因此探针的 RNA 部分被切断，淬灭物质脱离 荧光色素，故荧光色素发出荧光。 iPLEX 利用质谱分析可同时检测 24 个左右的突变。灵敏度 5%左右。 SMAP 法法 使用从高热分支杆菌中分离得到的新 DNA 聚合酶快速扩增核酸，该方法是利用快速核酸扩增 系统的突变检测系统。灵敏度 1%左右。 其它突变检测方法有高分辨熔解曲线分析（HRMA）等，表 2 中列举了文献中主要方法的灵敏 度和特性 46） 。 EGFR 基因检测基因检测中中使用的临床样本及其处理使用的临床样本及其处理 来自不同组织样本或细胞学样本均有可能发生基因突变。 在选择样本和检测方法时，详细了解其特点非常重要。上述的检测方法不同灵敏度不同，与此 相同，作为检测对象的样本不同，其肿瘤细胞的确认方法和含量也不同，因此需要特别注意。此 外，由于检测公司不能确认肿瘤细胞是否存在，因此其确认的责任应由送检医师承担。如果要确认 肿瘤细胞存在与否，与病理诊断医生密切合作是非常必要的。 1肿瘤部位新鲜冷冻材料：可提取出最高品质的 DNA、RNA。在手术现场切割取样的情况 表 2 主要 EGFR 突变检测的灵敏度和特性 46） 方法 灵敏度 （%突变 DNA） 发现的突变 缺失、插入的综合分 析 直接确定碱基序列 25 已知、未知 可 PCR-SSCP 10 已知、未知 可 Taqman PCR 10 仅已知 不可 Loop hybrid motility shift assay 7.5 仅已知 可 Cycleave PCR 5 仅已知 PCR-RFLP 5 仅已知 不可 长度（片段）分析 5 可 MALDI-TOF based 5 仅已知 不可 PNA-LNA PCR clamp 1 仅已知 不可 Scorpion ARMS 1 仅已知 不可 dHPLC 1 已知、未知 可 单分子测序 0.2 已知、未知 可 突变富集 PCR 0.2 仅已知 不可 SMAP 0.1 仅已知 不可 也比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病 变中心广泛纤维化的肿瘤的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。切割后取其中一半，并利用 另一半切面制作组织标本，然后进行确认。 2活检组织的石蜡切片：制作 5 片切片，其中 1 片进行 HE 染色，并确认肿瘤细胞的存在。特 别是 TBLB 标本，病理诊断后再切薄，由于在制作好的标本中基本上没有组织，肿瘤细胞也已消 失，因此需要注意。如果预计提前进行 EGFR 突变检测，在制作标本时多制作一些未染色标本（白 片）也很有用。此外，即使病理诊断报告书上写明有肿瘤细胞，其含量也各不相同，最好靠病理医 xi 生在诊断书上记录有多少肿瘤细胞。 检测公司有时也会要求厚切片（10 um） ，但多数情况下也可以是 5 um 左右（虽然大多检测实 验室应该可以用几片未染色标本进行研究，但是销售代表不知道，且不能检测的样本也不能收取费 用，因此常常会多要求。最好是直接咨询检测人员） 。 在利用 PCR 的高灵敏度检测系统中，如果 DNA 中含有 1%左右来自肿瘤细胞的 DNA，则可以 检测出突变，大部分活检病理标本是没有问题的。直接测序法需要肿瘤细胞的含量在 20%左右。 3手术样本的石蜡切片：制作 5 片连续切片，其中 1 片进行 HE 染色，并确认肿瘤细胞的存 在。DNA 容易受固定的影响，长时间（1 周以上）浸泡在福尔马林中的样本的 DNA 会被片段化， 不能检出突变。手术样本因各试验机构的不同，其固定方法、时间等也不同，对此，活检材料的固 定时间一般是 1 昼夜，虽然肿瘤细胞的量很少，但大多可以保证 DNA 品质。在高灵敏度检测方法 中，我们也考虑使用活检标本（图 4A） 。 4支气管洗涤液、胸水、心包液：必须确认肿瘤细胞。在基因检测用时，将提交给细胞学等临床 检查之后的剩余液体冷藏/冷冻保存，或在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓 冲液（AL 缓冲液（Qiagen 公司） ）等，混合，室温保存。由于细胞学样本的癌细胞含有量较低，因 此必须使用高灵敏度检测方法。 图图 4. EGFR 基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成 10 微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐 水中洗净（悬浮） ，可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于 AL缓冲液，此状态可以室温保存。 5经支气管刷检细胞、经支气管穿刺针吸细胞和淋巴结穿刺针吸细胞，痰：将擦刷、穿刺针 和痰用生理盐水或 PBS 充分悬浮之后分成一半，一方面提交给细胞学检查，在基因检测用时，将 剩余液体冷藏/冷冻保存，或离心后在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液 （AL 缓冲液（Qiagen 公司）等） ，混合，室温保存。因为痰样本本身可能已经变性，所以加入含有 蛋白质变性剂的缓冲液（AL 缓冲液（Qiagen 公司）等） ，混合，室温保存。由于样本间的肿瘤细胞 量差异显著，因此在进行消除上述样本差别操作的同时，需要使用高灵敏度检测方法（图 4B、 4C） 。 6血液：血液是容易采集的样本，如果稳定且可检出突变的话，则是理想的样本，但是目前 还处于研究阶段。有报告显示，利用从血浆或血清中提取的可溶性 DNA 也可以检出突变 47） ，但是 有关取自肿瘤的 DNA 的报告很少，且需要使用 Scorpion-Arms 法等灵敏度非常高的检测方法。 2008 年发表了利用上皮特异性抗体包被的微柱捕捉循环血中的癌细胞（circulating tumor cell:CTC） ，并进行 EGFR 基因分析的报告 48） 。报告显示，使用该方法的重现性较好，可以进行 EGFR 基因分析。而且该方法的灵敏度比血浆好，但是目前还不能应用于临床。 xii 委托几个检测公司进行 EGFR 突变检测。各公司的检测方法不同，直接测序法（SRL） 、PCR invader（BML） 、PNA-LNA PCR clamp（三菱美迪恩斯） 、突变富集 PCR（AVSS） ，Scorpion ARMS （国内出售整套试验器材的是罗氏诊断公司，目前，正准备委托检测中心进行检测）等 。 医疗保险诊疗方面的注意事项医疗保险诊疗方面的注意事项 根据 2007 年 6 月 1 日厚生劳动省保险局医疗科办公室备忘录，可以对以下项目中 D004 的 13 个恶性肿瘤基因检测进行推算。 肺癌的 EGFR 基因检测或 K-ras 基因检测 胰腺癌的 K-ras 基因检测 恶性骨软组织瘤的 EWS-Fli1 基因检测、TLS-CHOP 基因检测或 SYT-SSX 基因检测 消化道间充质瘤的 c-kit 基因检测 家族性非息肉病性大肠癌的微卫星不稳定性检测 2008 年 4 月的诊疗报酬修改中 1 名患者仅可算 1 次，此外，据说要将检测目的、结果及选择的 治疗方法记录在诊疗报酬明细单上*。下面列举明细单实例。 据三菱美迪恩斯报告显示，2007.42008.9约10000例样本的EGFR基因突变阳性率如下：DNA接收的样本为44%、接收组织 的样本为39%、石蜡片（paraffin slide）为43%、石蜡切片为40%、石蜡块为42%、胸水为34%、支气管洗涤液为24%。测） 等 。 三菱化学美迪恩斯制定的样本提交要点。新鲜组织，0.5 g，超低温冷冻（-70） ；石蜡包埋病理块，0.5 g；石蜡包埋病理 切片，5M510 片，室温；胸水，BAL 液，1ml，冷藏，3 日以上冷冻（-20） ；本检测不太推荐使用血液、血浆、血 清。推荐预先用染色、细胞学等进行确认。 BML 制定的样本提交要点。组织（手术时切除） ，最大 50 mg（米粒大）左右，冷冻-20（可能的话进行超低温冷冻） ； 组织（TBLB 活检） ，1数个芝麻粒大，冷冻-20（可能的话进行超低温冷冻） ；胸水（心囊水、腹水等） 、支气管肺泡洗涤 液（BAL） ，1050 ml 左右，冷藏（3 日以内） ，支气管镜刷检细胞学样本，尽量获得的标本，石蜡病理标本（未染色切片） 石蜡病理标本（块） ，仅需 1 个，10 m 厚 510 片左右，室温。由于不能确认样本中癌细胞的存在，因此希望提交前利用 细胞学、组织学对其进行确认。因为福尔马林固定时间的长短、福尔马林的 pH、固定组织的大小、块的保存时间等不同， DNA 片段化而过度发展，不论组织切片的大小、片数多少，都不能进行 PCR 扩增，因而也不能检测。任何材料，只要比上 述的目标量少，就可以实施检测，但是检出灵敏度可能会下降，有关“突变阴性判定”需要慎重解释。 *D004 穿刺液/采集液检测的 15 个恶性肿瘤基因检测 2,000 分 注 以实体肿瘤的肿瘤细胞为样本，利用 PCR 法、SSCP 法、RFLP 法等，以恶性肿瘤的详细诊断及治疗方法的选择为目的， 对恶性肿瘤患者本人进行 15 个恶性肿瘤基因检测，针对肺癌的 EGFR 基因检测或 K-ras 基因检测、中略，1 名患者只能 估算 1次。在估算恶性肿瘤基因检测时，将其目的、结果及选择的治疗方法记录在诊疗报酬明细单的摘要栏中。 xiii D004-15 恶性肿瘤基因检测 【对象】肺活检标本（P） 【目的】众所周知，EGFR 基因突变与吉非替尼和埃罗替尼的疗效呈高度相关，报告显示有效 率在 80%左右。此外，由于 6%会发生严重的间质性肺炎，因此为了充分研究利益和所预测的 危险，进行了本研究。报告显示，没有 EGFR 基因突变的病例中出现患有 K-ras 基因突变的病 例，对这些病例的有效率为 0%。希望对这样的病例给予吉非替尼时要更慎重。 【方法】从石蜡切片中提取 DNA，利用 CYCLEAVE 法，研究了 EGFR CODON858、K-RAS CODON12 的点突变，利用 FRAGEMENT 分析，研究了 EGFR EXON 19、EXON 20 的基因缺 失或基因插入。 【结果】 1. EGFR 基因：检出了 Exon21、L858R 的突变。 2. K-RAS 基因：未能检出密码子 12/13/61 的突变。 【与治疗方法的关联】 根据本检测结果，期待着 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的治疗效果，以该信息基础，开始给予易瑞 沙（iressa） 。 质量保证质量保证 希望在可保证正确基因检测的检测机构实施。必须是制定标准操作规程（SOP）后实施检测的机 构。所推荐的检测方法的 QA 参数是检测方法的灵敏度、特异性、方法的检验、成功率、成本等。 这 些 参 数 在 原 则 上 请 依 据OECD分 子 基 因 检 测 质 量 保 证 指 南 （/dataoecd/43/6/38839788.pdf） 。检测间的灵敏度和特异性比较研究是紧迫的课 题。 EGFR-TKI 的其它效果预测因子的其它效果预测因子 若干报告显示，除 EGFR 基因突变以外，还有其它与 EGFR-TKI 的敏感性有关的因子。因此， 我们认为其中也存在与 EGFR 基因突变间接相关的因子。 1. 配体水平的变化配体水平的变化 利用表达谱研究了吉非替尼的有效病例和无效病例中表达不同的基因之后，发现无效病例中配 体双调蛋白和 TGF 的表达较高 49） 。此外，血液中这些配体浓度的升高与吉非替尼的敏感性呈负相 关。 HER 家族的配体以与细胞表面结合的形式合成，用 sheddase 蛋白酶切断。ErbB 配体的 sheddase 属于 ADAM（解聚素-金属蛋白酶）家族，特别是 ADAM10 和 17 的影响较强。多数的肺 癌细胞株都表达 ADAM17，在这类的细胞中 ERBB3 的配体 heregulin 增加 50） 。ADAM 的抑制剂 INCB4298 通过将这个 autocrine 环切断来提高吉非替尼的敏感性，由此认为，ADAM17 抑制 EGFR- TKI 的效果 50） 。 2.EGFR 基因扩增基因扩增 Cappuzzo 等人通过试验预测吉非替尼对突变的有效性，试验对比吉非替尼对应用荧光原位杂 交技术（FISH）检测出的 EGFR 基因拷贝数增加和 EGFR 突变的治疗效果，研究结果表明，吉非替 尼对前者治疗更有效（总生存时间对应的 P 值因突变比 0.09 增加 0.03）51 ） 。这里应该注意的