蛋白水解度测定方法

蛋白水解度（DH）测定方法OPA 法 一、 定义 水解度（DH）是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本计算公式如下： DH = 被水解的肽键数 蛋白质总肽键数 100% = h htot 100% htot 的值根据不同的底物蛋白会有所不同，h 是用等价 serine NH2 表示的。 = 2 meqv/g protein 更多 ，htot 的精确数值请参见备注。 此处的 DH 是指样品相对于原始底物的水解度，如果要计算水解反应前后的水解度，需要 使用如下公式： DH = h1 h0 htot 100% h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度； h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。 二、 原理 OPA（邻苯二甲醛）法测定蛋白质水解度的原理是 OPA 在 -巯基乙醇的存在下会与自由 - 氨基形成黄色化合物，其在 340nm 处有特征吸收，用分光光度计可检测其 OD 值。实际使 用中 1，4 二巯基苏糖醇（DTT）比 -巯基乙醇更易使用。 三、 试剂 测试所需试剂及设备如下： 硼砂 （CAS 1303-96-4） AR 十二烷基硫酸钠（SDS, CAS 151-21-3） AR 邻苯二甲醛（OPA，CAS 643-79-8，纯度 97%） （sigma） 1,4-二巯基苏糖醇（DTT，CAS 3483-12-3，纯度 99%） （sigma） 丝氨酸（serine）标准品 （CAS 302-84-1） （sigma） 紫外可见分光光度计（可测 340nm 吸光值） 容量瓶 100ml，200ml，500ml 各数个 10ml 测试管数个 3.1 OPA 试剂 A1. 将 7.620g 硼砂（CAS 1303-96-4）和 200mg 十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于 150ml 去离子水中。溶解完全后方可加入其他试剂。 A2. 将 160mg 邻苯二甲醛（OPA，纯度 97%）溶解于 4ml 无水乙醇中。溶解完全后 将此 OPA 溶液转移至上述 A1 溶液中，并用去离子水冲洗，转移。 A3. 将 176mg 1,4-二巯基苏糖醇（DTT，纯度 99%）加入到 A1 溶液中，去离子水冲 洗，转移。 A4. 用去离子水将 A1 溶液定容至 200ml. 此试剂现配现用。 3.2 丝氨酸标准溶液 将 50mg 丝氨酸（serine）溶解于 500ml 去离子水中。此溶液中 Serine-NH2约为 0.9516 meqv/L. 3.3 样品溶液 将 Xg 样品溶解于 100ml 去离子水中，X 的值在 0.11.0 之间。 如果样品蛋白含量为 80%，则 X 取 0.1g，如果样品蛋白含量为 8%，则 X 取 1.0g。 *水解实验中可取 100ul 水解样品加入到 900ul，5%（W/W）热的（85）SDS 溶 液中，保温 5min 灭酶。样品保存在-18以备测试。计算时注意蛋白浓度的变化。 四、 测试步骤 使用分光光度计测试所有样品的 340nm 吸光值，空白对照为去离子水。 1. 加 3ml OPA 试剂到所有的测试管中。 分析一个样品所需的测试管： 标准溶液 4 个 空白 4 个 样品溶液 22 个 每个样品须测 2 次，每次需有一个平行样，故需 4 个测试管。 2. 标准溶液测试 将 400ul 丝氨酸标准溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中（时间点 0）， 混合均匀（5S）后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 在测空白和样品值之前测 2 个标准品，另 2 个标准品在测完空白和样品后再测。标 准品的吸光值取 4 次的平均值。 一般情况下 ODstand.0.8 3. 空白测试 将 400ul 去离子水加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中（时间点 0），混合均 匀（5S）后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 测 4 次空白取平均值。一般情况下 ODblank0.07。 *如果用 5% SDS 溶液取样灭酶，则空白就是 5% SDS 溶液。 4. 样品测试 将 400ul 样品溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中（时间点 0），混合均 匀（5S）后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 因为吸光值会随时间变化，所以读取 OD 值的时间必须是同样的（2min）。 五、 计算 5.1 计算 h Serine NH2= . 0.9516meqv/L0.1100 / Serine NH2 meqv serine NH2/g protein X g sample (0.11.0g) P protein % in sample 0.1 sample volume in L h= 2 meqv/g protein 各底物的 和 具体数值见附表。 如果未对底物进行测试， 和 可按 1.00 和 0.40 粗略计算。 5.2 计算 DH DH= 10 *100% h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度； h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。 备注： 大豆、面筋、酪蛋白、乳清、明胶、肉、鱼 OD 值在 0.21.2 之间的读数会比较准确，太小或太大精确度都会有影响。因此须注 意丝氨酸标准品浓度和样品中蛋白浓度是否合适。 Reference P.M. Nielsen, D.Petersen, and C. Dambmann,