表达载体的构建方法及步骤VIP

表达载体的构建方法和步骤一、载体的选择和质粒图像的读法目前载体主要有病毒和非病毒两种，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。合格质粒的组成部分：(1)复制开始部位Ori是控制复制开始的部位。 原核生物DNA分子只有一个复制起点。 然后呢真核生物DNA分子有多个复制起始部位。(2)抗生素耐药基因如Amp、Kan可简单检测(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段(4) P/E启动子/增强子(5)Terms结束信号(加入poly(A )信号有稳定mRNA的作用选择载体主要是出于构建目的，同时必须考虑载体中适当的限制酶切位点。 建立起来的目的选择适当的表达载体来表达特定的基因。职业选择主要考虑以下三点【1】为构建DNA重组体，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：(1)根据克隆载体的克隆能力克隆片段大小(总选举大、小选举小)。 例如选择10kb质粒。(2)表达载体为受体细胞类型原核/真核/梭菌，E.coli/哺乳类细胞表达载体。(3)应注意原核表达载体：选择合适的启动子和相应的受体菌，表达在表达真核蛋白时注意克服4个困难和阅读框架的偏差的天然蛋白质和融合蛋白质，可作为相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数和组成方向因载体而异，适应目标基因和载体容易链接，读帧不会产生偏差。如上所述，选择质粒(最常用)作为载体的5点要求：(1)分子量小的质粒，即小载体(1-1.5kb)不易破坏，细菌中拷贝数也多(也有大负荷)。身体(2)常用的松弛型质粒在细菌内扩增不受限制，一般为10个以上拷贝，严密型质粒为10个。(3)具备一个以上酶切部位，有选择馀地；(4)需要易检测的标记，抗生素耐药基因较多，未指出特别多的Ampr。(5)满足自己的实验需要，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标记蛋白质，是否需要真核抵抗性(Puro，G418等)等。无论选择哪个载体，首先获得载体分子，用适当的限制酶切断载体DNA，为了便于与目标基因片段结合，获得线性载体分子。如何阅读质粒图像第一步：首先观察Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/梭质粒)步骤2 :观察筛选标记，决定使用抵抗性等哪个筛选标记。(1)Ampr水解-内酰胺环，解除氨苄青霉素的毒性。(2)tetr阻止四环素进入细胞。(3)camr生成氯霉素的羟乙酰基衍生物，失去毒性。(4)neor(kanr )氨基糖苷磷酸转移酶使G418 (卡那霉素衍生物)失活(5)hygr使赤霉素失活。步骤3 :观察多克隆部位(MCS )。 有几个单一的限制酶的点。 外源基因插入容易。 如果在这些酶切部位以外插入外来基因，会导致某些标记基因失活，使筛选变得容易。 决定是否放置目标基因，是否放置目标基因。第四步：看看外源DNA插入片段的大小。 质粒一般只能容纳不足10Kb的外源DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长越难插入，不稳定，转化效率低。第五步：表达系统的要素，即启动子-核糖体结合部位-克隆部位-转录终止信号是否包含在内。 这是为了区分克隆载体和表达载体。 在克隆载体中加入与表达控制相关的要素，成为表达载体。 选择那个载体，还是要以实验目的为基准。步骤6 :启动子-核糖体结合部位-克隆部位-转录终止信号(1)促进启动子DNA转录的DNA序列，该DNA区域是基因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上与RNApol特异性结合开始转录的部位，但启动子本身不能转录。(2)增强子/沉默子是真核基因组(包括真核病毒基因组)之一，具有增强邻近基因转录过程的调控步骤。 其作用与增强子所在的位置和方向无关。 即在调控基因的上游或下游起作用。 /沉默子-负增强子、负控制系列。(3)核糖体结合部位/开始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体两个结合部位，对原核来说是AUG (开始密码)和SD序列。(4)转录终止序列(终结者) /翻译终止密码子：结构基因的最后外显子中有AATAAA的保守序列，该部位的down-stream中有GT或t丰富区，这两部分共构成poly(A )的末端信号。 结构基因的最后外显子有AATAAA的保守序列，该部位的down-stream有GT或t富集区，这两个部分共同构成poly(A )的拖尾信号。质粒图有顺时针箭头，有逆时针箭头，但其实代表两条DNA链，质粒是环状双链DNA，其启动子等在一条链上，其抗性基因在另一条链上。 不同表达宿主在构建时选择的载体不同。二、获得目标基因一般来说，获得目的基因有三种方法基因的采集：目标基因序列表明，设计引物通过PCR方法从含目标基因的cDNA中采集目标基因，链接到克隆载体，采集单克隆以确定序列，得到目标基因片段的方法成本较低，但采集的基因多包括突变有时基因表达丰富程度不同，转录本复杂，有时基因片段长，难以取得目标基因。全基因合成：根据目标基因的DNA序列，直接设计合成目标基因。 该方法准确性高，相对成本高，个人操作困难，需要建立专业的合成公司。 优点是可以合成难取的基因序列和人工改造的基因序列，同时优化密码子，提高目标基因在宿主内的表达量。三、克隆建立目前克隆构建方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接外，目前还有许多不依赖酶切部位的克隆构建方式。 以下具体说明双酶切法构建载体的步骤。实验材料实验试剂试剂名制造商载体pCDNA3.1Transheep大肠杆菌菌株DH5天根市限制性内切酶FermentasT4脂肪酶Fermentas质粒DNA小，大量提取试剂盒axxygen凝胶回收试剂盒axxygen阿加罗斯特BiowestDNA ladderFermentas(2)X基因慢病毒载体的构建x基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57。PUC57-X基因EcoRI/BamHI酶切结果：酶切结束后进行糊回收2 .载体用pCDNA3.1双酶切割，酶切系统如下：20ul酶切系统37度3小时4ul pCDNA3.1载体(500 ng/ul )1ul BamHI1ul EcoRI2ul 10缓冲器12 ul H2O酶切完成后的胶回收(见附录)处理后的目的段与载体连接反应体系6ul PCR酶切回收片段(约50ng/ul )用1ul酶切的载体(约50ng/ul )2ul ligase buffer第四代ligase10ul H2O以上连接液在16下过夜。转化(诱导细胞： DH5a )，具体步骤见附录转化部分。耐受性： Amp； 37，培养一夜转化的x基因分别用平板筛选细菌，在37 250转/分钟摇晃细菌14小时，用PCR鉴定后，将阳性细菌液送到上海权阳生物技术有限公司决定序列。x基因慢病毒载体单克隆菌落的PCR检测(使用载体通用引物，PCR带的大小必须比实际大200bp左右)。不能用于只有个人用于学习、研究的业务用途。forpersonaluseonlyinstudyandsresearch； 不是commercialuseNur fr den persnlichen fr Studien，Forschung，zukomerzilenezwecknverwendetwerden。pourltudeetlarechercheuniquementdesfinspyspersonneles； pas des fins commerciales嘻嘻2卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡以下无正文不能用于只有个人用于学习、研究的业务用途。forpersonaluseonlyinstudyandsresearch； 不是commercialuseNur fr den persnlichen fr Stud