第三章基因重组.ppt

,欢迎,第三章可移动的遗传因子和染色体外的遗传因子,第一节转座子第二节质粒第三节遗传重组,基本要求,1.掌握转座子的定义2.了解转座子机制3.掌握质粒相关特性4.掌握同源重组的模型，位点特异性重组5.重点掌握相关定义,第一节转座子,一.转座子的发现二.转座子的定义与结构特征三.转座子机制四.转座效应五.逆转录转座子,DNAtransposableelement,一.转座子的发现,1951年，在冷泉港生物学专题讨论会上，麦克林托克递交了自己的学术论文，向科学界同行报告了她的新理论。她提出遗传基因可以转移，能从染色体的一个位置跳到另一个位置，甚至从一条染色体跳到另一条染色体上。她把这种能自发转移的遗传基因称为“转座因子”。“转座因子”除了具有跳动的特性之外，还具有控制其他其因开闭的作用，因此“转座因子”又可叫做“控制因子”。,转座理论不被接受,在当时，占统治地位的染色体遗传学理论认为，生物细胞内的遗传物质比较稳定，遗传基因以一定的顺序在染色体上作线性排列，彼此之间的距离也非常稳定。常规的交换和重组只发生在等位基因之间，并不扰乱这种距离。除了在显微镜下可见的、发生频率极为稀少的染色体倒位和相互易位等畸变可以改变基因的位置外，人们还从未认识到，也难以设想出基因会从一处跳跃到另一处。,终被接受,整个70年代，分子遗传学家找到了愈来愈多的可移动的或可转移的遗传因子，又称之为“跳跃基因”。这些因子不仅存在于细菌中，同时也存在于较高等的动物中。麦氏的理论又得到了进一步的验证。麦克林托克30年代初做出的发现、40年代提出的理论，到60年代末终于被重新提起，80年代初为科学界普遍接受。她走在时代前面四十年，同时也为此冷落奋斗了四十年。,二.转座子的定义与结构特征,DNA的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介导的遗传物质重排现象。已经发现转座这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。,转座子的定义,在原核生物和真核生物基因组中,存在着可以从一个部位转移到另一个部位的一些DNA序列,这些DNA序列就称为转座子(transposon)。,转座子的分类和结构特征,简单转座子（insertionsequence，IS）常被称为插入序列。它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，中间带有介导自身移动的转座酶,两端带有反向重复序列.,原核生物的转座子-插入序列IS,转座子的分类和结构特征,复合式转座子（compositetransposon）是一类带有某些抗药性基因的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。,复合转座子Tn,转座子A家族(TnA),是一类除了和它的转座作用有关的基因外,还带有其它基因的转座子.TnA长约5kb,两端具有ITR(38bp),而不是IS,中部的编码区不仅编码抗性标记,还编码转座酶和解离酶.靶点(5bp)的选择有区域倾向性,但在优先区域内选择是随机的.,转座噬菌体,是一种以溶菌和溶源周期性交替方式生长的噬菌体,它不象噬菌体那样有一定的整合位点.Mu噬菌体的整合特征将在基因表达与调控一章讲解.,三.转座子机制,转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同。,三种不同类型的转座,（1）复制型转座（replicativetransposition）作为自身移动的一个部分，转座子被复制，一个拷贝仍然保留在原来的位置上，而另一个则插入到一个新的部位，这样转座过程伴随着转座子拷贝数的增加。,（2）非复制型转座转座元件作为一个物理实体直接由一个部位转移到另一个部位。IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。,（3）保守型转座保守型转座是另一种非复制型的转座过程，该过程中转座元件从供体部位被切除并通过一系列的过程插入到靶部位，在该过程中每个核苷键皆被保留。该转座过程与的整合机制类似，并且转座酶与整合酶家族有关。,转座的机制：复制型转座需要融合形成共合体A.切开：转座酶识别受体的靶序列，在两条单链上均切开，形成粘性末端；识别自身的反向重复序列，在3端切开。B.连接：供体和受体结合形成不完整共联体，留下缺口。C.复制：DNA聚合酶补齐缺口，再连接形成完整的共联体，具有重复序列。D.重组：在特定位点进行重组，共联体分离：留下原来的转座子；并在靶序列上插入转座子，两端有同向重复序列。,非复制型转座断裂和重接反应使靶重构。供体保持裂缺。不形成共合体。,Tn10转座需要的酶及转座频率的控制,四.转座效应,转座引起插入突变转座产生新的基因转座产生的染色体畸变转座引起的生物进化.,五.逆转录转座子,关于逆转录病毒复制的内容将在复制一章讲解。逆转录病毒的转座请看视频。,第二节质粒,一.质粒的定义二.质粒的类型三.质粒的特性四.特殊细菌质粒,一.质粒的定义1.1定义和命名质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的，符合这三条标准的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。狭义的质粒一般是指细菌染色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小写字母p加2-3个大写字母和数字，如pJP4，pDTG1。,1.2细菌质粒,细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子(cccDNA)。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生质粒等类型。,1.3真核生物的DNA质粒,环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线立体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。,1.4真核生物的RNA质粒,有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒。,二.质粒的分类：,根据质粒能否通过细菌的接合作用进行传递1接合性质粒2非接合性质粒根据质粒在细菌内拷贝数多少1严紧型质粒2松弛型质粒根据相容性1相容性几种质粒同时共存于同一菌体内2不相容性不能同时共存可借此对质粒进行分组、分群,特殊细菌质粒1）F质粒（致育因子）Tra区：编码转移相关蛋白；合成性纤毛,2）R质粒（抗药因子）-RTF基因（抗性转移因子）-抗性决定子（抗抗生素、抗药、抗种金属）,3）Col质粒（大肠杆菌素因子）-产大肠杆菌素细菌素：由细菌质粒编码产生的只能抑制或杀灭近缘细菌或同种不同菌株的蛋白质。,4）致病性质粒：-肠毒素、内毒素（E.Coli）-溶血素、肠毒素（S.aureus）5）共生固氮质粒：-结瘤基因（nod）-固氮基因（nif）6）隐蔽质粒：未有明确表型,具有自我复制的能力拷贝数低者，复制往往与染色体的复制同步，称为紧密型质粒。拷贝数高者，与染色体的复制不相关，称松弛型质粒。编码的基因产物能赋予细菌某些特性（非细菌生命活动不可缺少的）,三.质粒DNA的特征,质粒可自行丢失与消除质粒的转移性质粒的相容性与不相容性两种结构相似密切相关的质粒不能稳定共存于一个宿主菌的现象称为质粒的不相容性。几种不同的质粒同时共存于一个菌细胞内则称相容性。,第三节遗传重组,一.同源重组二.位点特异性重组三.等位基因间重组,遗传重组引言,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(geneticrecombination),或者基因重排(generearrangement)。重组产物为重组体DNA(recombinantDNA)。DNA的重组广泛存在于各类生物。真核生物基因间重组多发生在减数分裂(meiosis)时同源染色体之间的交换(crossover)。细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代两组DNA之间可通过多种方式进行遗传重组。,遗传重组总结,遗传重组：造成基因型变化的基因交流过程。发生：减数分裂性细胞内，体细胞地点：核基因间，叶绿体基因间，线粒体基因间；前提条件：不同基因型的遗传物质彼此能够转移。作用：保证了遗传多样性,为选择奠定了物质基础,使生物得以进化发展，与突变一起是变异的来源,DNA重组对生物进化起着关键的作用。生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程。生物进化以不断产生可遗传的变异为基础。首先有突变和重组，由此产生遗传的变异，然后才有遗传漂变(geneticdrift)和自然选择(naturalselection)，才有进化。可遗传变异的根本原因是突变。然而，突变的机率很低，而且多数突变是有害的。如果生物只有突变没有重组，在积累具有选择优势的突变同时不可避免积累许多难以摆脱的不利突变，有利突变将随不利突变一起被淘汰，新的优良基因就不可能出现。重组的意义在于，它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)；使有利突变与不利突变分开(separation)；通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。,遗传重组的生物学意义,遗传重组主要类型：(依据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求)同源重组位点专一性重组转座重组异常重组其共同点是双股DNA间的物质交换，但发生的情况不同。,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。真核生物非姊妹染色单体的交换，姊妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转导、接合等都属于这类型。,一、同源重组,同源重组的Holliday模型,RobinHolliday于1964年提出了重组的杂和DNA模型，又称Holliday模型。该模型对重组过程的解释如下：A、同源的非姐妹染色单体联会；B：同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开；C：切开的单链交换重接;D：形成交联桥结构；,E：交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（Holliday结构）F：绕交联桥旋转1800；G：形成Holliday异构体；H、通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。,HOLLIDAY模型,Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。MeselsonM和RaddingC对此提出了修正意见，他们认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一DNA分子的同源区，造成链的置换，被置换的链再切断并与最初断链连接，即形成Holliday中间体。,Meselson-Radding模型,Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，1975年Meselson-Radding提出模型解释这种不对称重组现象：1.单链切断2.链置换3.单链入侵4.泡切除5.链同化（碎链吸收）6.异构化Holliday7.分支迁移,Holiday中间体,目录,交互重组,拼接重组,目录,旋转,双链断裂重组模型,更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。,双链断裂启动重组,细菌的基因转移与重组,细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，细菌的基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合(cellfusion)。,1细菌的接合作用细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞，称为接合作用。供体细胞被定义为雄性，受体细胞为雌性。通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒(conjugativeplasmid)提供的，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。,F质粒的接合,F+,F-,F+,F-,F+,F+,F+,F+,Donor,Recipient,F+,2细菌的遗传转化遗传转化(genetictransformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competentcell)。很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等)。,目录,3细菌的转导转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。转导有两种类型：普遍性转导(generalizedtransduction),是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；局限性转导(specializedtransduction)，某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代。缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组。,同源重组的酶学,同源重组需要许多蛋白因子参与,其中编码这些蛋白质的基因有27种,起最主要作用的,并且了解较清楚的的有蛋白质RecBCD,RecA,RuvAB和RuvC.,RecBCD酶是一种多功能酶,该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。RecBCD酶具有三种酶活性：依赖于ATP的核酸酶活性，ATP依赖的解螺旋酶活性，ATPase活性。当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5GCTGGTGG3)，在其3侧46个核苷酸处将链切开，产生具有3末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组的chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。,RecA蛋白,在大肠杆菌中，RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)。所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝(helicalfilament)。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。,图4-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型A:DNA链交换的侧面观:1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来;B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面,RuvA可识别Holliday连接的结构；RuvB是一种ATPase，它可发动迁移反应。右图表示复合体的功能。RuvA结合在交换点上的所有4条链上。RuvB是六聚体，它围绕在交换点上游的每一条DNA双链的周围。ruvC编码一个可特异识别Hollidy分枝结构的内切酶，该酶可切开Holliday连接体，解离重组中间体。,RecBCD途径,RecBCD蛋白在chi位点3侧的一条链上产生切口。RecBCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使chi位点附件切口的DNA解链单链区被RecA蛋白和SSB蛋白覆盖RecA蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分Dloop区域的DNA产生切口，新切口的3端（thetailofnewlynickedDNA）与另一条DNA的单链区互补配对DNA连接酶封闭切口，形成HollidayjunctionRuvA和RuvB发动迁移反应RuvC拆分重组中间体,二、特异位点重组,特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短的(20200bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助因子对其识别和作用。,位点专一性重组/保守性重组,原核生物中最为典型特点：供体与受体的特定位点的短同源序列之间。DNA精确切割连接,噬菌体DNA通过其attP位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间专一性重组而实现整合过程。条件：一段15bp的同源序列和位点专一性的蛋白质因子（不能催化其他任何两条不论是同源的还是非同源序列间的重组，从而保证了噬菌体整合方式的专一性和高度保守性，因此又称保守性重组。）而且这一重组不需要RecA蛋白质的参与.,1.噬菌体对E.coli的整合,噬菌体的整合与切除噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不同生活