07 实验七 亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质(GST、SDS-PAGE).ppt

实验七亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质,实验目的,掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法（第一部分）掌握SDS-PAGE检测目的蛋白原理和方法（第二部分）,第一部分GST亲和层析纯化目的蛋白,亲和层析原理,生物大分子与配体特异非共价结合。酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂）抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补序列（Oligo-dT）,亲和层析原理,GST亲和层析,谷胱甘肽（GSH）作为配体，共价结合在葡聚糖（Sepharose4B）上谷胱甘肽硫转移酶（GST，26KD）及其融合蛋白GST与葡聚糖上的GSH结合用游离的GSH洗脱GST,GSH-Sepharose4B,GSH-Sepharose4B,GSH-Sepharose4B,亲和层析流程,第一部分实验步骤,一、细胞破碎,3600mL诱导的菌液，离心分装到12只50mL离心管，-20保存；（每个班用2管）每管加30mLPBS缓冲液，混匀；超声3S，暂停5S，持续15min；4，10000rpm，离心10min；取50uL上清，作为纯化前的样品；每组取3-5mL上清液，上柱纯化。,二、装GSH-Sepharose4B柱,1.清洗和装好层析柱，封闭出口；2.加入2mLPBS；3.取1-2mLGSH-Sepharose4B，加入柱子中；4.打开柱子出口，使PBS缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于GSH-Sepharose4B,三、纯化目的蛋白,1.用5mLPBS缓冲液洗柱子，重复3遍。2.将混合蛋白质溶液2-3mL加到柱子中。3.用5mLPBS缓冲液洗柱子，重复3遍。4.加入1.0mL洗脱液。5.用1.5mL离心管收集洗脱液，每管收集0.2mL（3-4滴），共收集5管。6.用5mLPBS缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。7.SDS-PAGE检测第2和3管中的目的蛋白。,四、SDS-PAGE样品制备,1号：过柱前的蛋白溶液80uL2号：收集的蛋白溶液（2号管）80uL3号：收集的蛋白溶液（3号管）80uL1-3号分别加入20uL5上样缓冲液，混匀后在沸水中加热3min。,123M123M,亲和层析试剂,PBS（pH7.4）:NaCl（58.5）40g；KCl（74.5）1.0g；KH2PO4（136.09）1.2g；Na2HPO412H2O（358.14）18.1g；加水定容到5000mL。,亲和层析试剂,50mMTris-HCl（pH8.0）:Tris（121.14）6.055g，溶于900mL水，用HCl调pH到8.0，用水定容至1000mL。洗脱液:还原型谷胱甘肽（307.32）0.15366g，溶于50mL50mMTris-HCl（pH8.0）中。,第二部分SDS-PAGE检测目的蛋白质,实验目的,掌握SDS-PAGE检测蛋白原理和方法掌握垂直板电泳的实验方法,蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm,实验原理,连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。（电荷效应、分子筛效应）不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）,1.凝胶孔径的不连续性（2种孔径）2.缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-低，比Gly高。,浓缩效应,3.电位梯度不连续性：快离子（Cl-）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。,浓缩效应,实验步骤,1.洗净玻璃板，吹干，安装制胶器；2.制作12%分离胶。按下表顺序加试剂，混匀，加入玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；3.用1mL蒸馏水封住液面，室温30min，分离胶与水之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；4.配制5%浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，静置30min；,12%分离胶,5%浓缩胶,5.将胶板放入电泳槽，加入1Tris-Gly电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子；6.点样：每个样点30uL，Marker点15uL；7.电泳：100V，约20min，样品进入分离胶后，将电压调到130V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停止电泳；,实验步骤,8.拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑料盒内，加入染色液，振荡30min；9.回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮4-5min，重复2-3次；10.观察胶中的蛋白质条带。,实验步骤,纯化前纯化后Marker,实验试剂,蛋白质分子量标准兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制剂20100鸡蛋清溶菌酶14400,实验结果,绘制标准曲线：logMW=K-bm蛋白质区带中心至分离胶上沿距离相对迁移率=溴酚蓝至分离胶上沿距离蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移率作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白的迁移率以及标准曲线，可以计算相对分子量。,SDS-PAGE试剂,1.30%（W/V）凝胶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）1.0g，加水到100mL。2.分离胶缓冲液（pH8.8，1.0mol/LTris-HCl）：三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，加80mL蒸馏水，用1.0mol/LHCl调节pH到8.8，用蒸馏水稀释到100mL。,3.浓缩胶缓冲液（1.0mol/LTris-HCl，pH6.8）Tris12.1g，加60mL蒸馏水，用1.0mol/LHCl调节pH到6.8，加蒸馏水到100mL。4.10%（W/V）SDS5.10%（W/V）过硫酸铵（现用现配）,6.10电极缓冲液（pH8.3）：Tris30.3g，Gly144.2g，SDS10g，加水到1000mL。（用时稀释10倍）7.蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加200uL水溶解，加50uL上样缓冲液。,8.上样缓冲液（5）：1.0moLTris