氨基酸的测定PPT演示课件

,氨基酸测定,047312120赵璐璐047312117王梦园,1,氨基酸的定义,它是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。氨基连在-碳上的为-氨基酸。组成蛋白质的氨基酸均为-氨基酸。,2,食品中蛋白质的氨基酸组成,蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，按照-氨基酸侧链R基团的结构可分为：脂肪族类：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。羟基类：丝氨酸、苏氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸酰胺类：天冬酰胺、谷氨酰胺含硫类：半胱氨酸、蛋氨酸芳香族类：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸亚氨基酸：脯氨酸,3,在构成构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠从食品摄入，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能。限制氨基酸：是指食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸缺少或数量不足，就会使食物蛋白质合成为机体蛋白质的过程受到限制，亦即限制了此种蛋白质的营养价值，这类氨基酸就称为限制氨基酸。评价某种蛋白质的营养价值包括两个方面：一是各种必需氨基酸含量是否丰富，二是必需氨基酸的构成是否符合一定比例。,食品中蛋白质的氨基酸组成,4,测定意义,随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法测定。色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出现多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成为现实。,5,氨基酸的定性测定,个别氨基酸的显色反应,茚三酮法吲哚醌法邻苯二甲醛法,精氨酸（坂口反应）胱氨酸和半胱氨酸甘氨酸脯氨酸丝氨酸和羟赖氨酸羟脯氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸和组氨酸（Pauly反应）,6,氨基酸的定量测定,个别氨基酸的定量测定,甲醛滴定法电位滴定法茚三酮比色法非水溶液滴定法邻苯二甲醛法三硝基苯磺酸法乙酰丙酮和甲醛荧光法,赖氨酸色氨酸苯丙氨酸酪氨酸脯氨酸羟脯氨酸胱氨酸谷氨酸,7,氨基酸的分离及测定,薄层色谱法氨基酸自动分析仪法气相色谱法高效液相色谱法,8,茚三酮法（以测定蜂蜜及果葡糖浆中的氨基酸含量为例）,双语例句,反应原理氨基酸在一定pH条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色(570nm)定量。注意：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化,方法如下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加1克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中，即出现蓝色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。,9,茚三酮法（以测定蜂蜜及果葡糖浆中的氨基酸含量为例）,双语例句,1.材料与方法：葵花蜜、洋槐蜜等；茚三酮、谷氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硼酸等。7200可见分光光度计等2.实验方法2.1氨基酸标准曲线的绘制准确称取100mg谷氨酸(纯度不低于99%)，溶于100mL水中，即母液。用此母液及磷酸缓冲液配制终质量浓度分别为0，20,40,60,80,100,150g/mL的标准溶液。取5mL标准溶液，加入1.0mL5mg/mL茚三酮溶液，沸水加热5min，冷却后加水定容至10mL,于570nm处测定吸光度，绘制谷氨酸标准曲线。,2.2回收率及精密度实验用去离子水将谷氨酸和果葡糖浆配制成谷氨酸含量分别为50,25,12.5,6.25g/mL的果葡糖浆样品。以未加谷氨酸的果葡糖浆为空白，采用茚三酮法测定其中的氨基酸含量。计算回收率和相对标准偏差(RSD)。2.3果葡糖浆中氨基酸含量的测定：取13份不同的果葡糖浆样品各5g，编号分别为HFCS1至HFCS13，采用茚三酮法测定每个样品的氨基酸含量。2.4蜂蜜中氨基酸含量的测定取冬蜜、拎蜜、洋槐蜜、葵花蜜、龙眼蜜，采用茚三酮法测定每个样品的氨基酸含量。,10,茚三酮法（以测定蜂蜜及果葡糖浆中的氨基酸含量为例）,双语例句,2.5蜂蜜与果葡糖浆混合物中氨基酸含量的测定根据1.3.3节测定结果，分别用氨基酸含量最低和最高的果葡糖浆将冬蜜、葵花蜜、洋槐蜜按不同比例混合成果葡糖浆含量为0,20%,40%,60%,80%的蜂蜜样品，采用茚三酮显色法测定每个样品的氨基酸含量。2.6数据处理方法每个实验做3次平行试验，实验结果用平均值表示。平均值及其他统计参数(标准差及相对标准偏差)的计算采用excel软件处理。,结论1)采用茚三酮显色法测定的蜂蜜及果葡糖浆的氨基酸含量在0150g/mL范围，该法具有线性好、准确性及精密度高等特点。2)蜂蜜与果葡糖浆混合物中的氨基酸含量和果葡糖浆掺入量呈良好的负线性关系。采用茚三酮显色法测定蜂蜜样品的氨基酸含量，可以快速判断蜂蜜中是否掺入了果葡糖浆。,11,甲醛滴定法,双语例句,反应原理原理将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定到酸度计指示的pH值为8.2为终点，记下所用的氢氧化钠的体积数V1,此时滴定的是游离酸,根据氨基酸的两性作用,再加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，继续用氢氧化钠标准溶液滴定到酸度计指示的pH值为9.2为终点,此时滴定的是氨基酸。,双指示剂：40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6）0.1%中性红50%乙醇溶液，（6.88.0）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。操作：取相同两份样品2030mg分别于250ml三角瓶各加50ml蒸馏水一份加中性红3滴用0.1mol/LNaOH滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml摇匀用0.1mol/LNaOH滴至淡蓝色。分别记录两次所消耗的碱液ml数。,（以测定氨杞精口服液中的氨基酸含量为例）,12,甲醛滴定法,计算：氨基酸态氮=c（V2-V1）0.014100）/W100V1用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积V2用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量,应用：氨杞精口服液是由天然原料提取的氨基酸粉(含20多种氨基酸)，加上构祀子、黄精煎煮液配制而成的口服液。其中氨基酸为主要有效成份，采用甲醛滴定法测定氨基酸的总量做为质量控制方法，操作简便。酱油的检测也可用此法。,（以测定氨杞精口服液中的氨基酸含量为例）,13,电位滴定法,双语例句,反应原理将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定到酸度计指示的pH值为8.2为终点，记下所用的氢氧化钠的体积数V1,此时滴定的是游离酸,根据氨基酸的两性作用,再加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，继续用氢氧化钠标准溶液滴定到酸度计指示的pH值为9.2为终点,此时滴定的是氨基酸。,仪器附磁力搅拌器的酸度计;25mL酸式滴定管;10mL胖肚吸管。,（以测定酱油中的氨基酸含量为例）,14,电位滴定法,（以测定酱油中的氨基酸含量为例）,操作方法：（1）样品处理：先测出待测酱油的比重，然后吸取酱油5.00mL于100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL烧杯中,加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用pH6.18的标准缓冲液校正好酸度计，然后将电极清洗干净，再插入到上述酱油液中，用NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2,记下消耗的NaOH溶液体积。（2）氨基酸的滴定：在上述滴定至pH8.2的溶液中加入10.00mL的中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下消耗的NaOH溶液体积。（3）空白滴定：吸取80mL蒸馏水于250mL的烧杯中，用NaOH标准溶液滴定至pH8.2,然后加入10.00mL中性甲醛溶液，再用NaOH标准溶液滴定至pH9.2,记下加入甲醛后消耗的NaOH溶液体积。,15,薄层色谱法,原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。,（以测定味精中的氨基酸含量为例）,Rf=a/b,16,薄层色谱法,操作方法：薄层板制备样品液制备点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔12cm。可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度1030，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。,（以测定味精中的氨基酸含量为例）,显色：a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）,17,氨基酸自动分析仪法,双语例句,样品的处理取含蛋白20mg的各种样品于水解管中，加12mL的6mol/L盐酸，滴入几滴苯酚，充氮后封管，置于1100C烘箱中保持22h，冷却后经滤纸过滤到50mL容量瓶中，用超纯水反复冲洗水解管及滤纸，最后定容至刻度。取1mL的样液于蒸发皿中在蒸气浴上蒸干，加超纯水重复三次，残留物用0.02mo1/LHCl定容至10ml。0.45m滤膜过滤，备用上机。,标准曲线绘制精确吸取经脯氨酸标准溶液0mL,0.5mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL,2.SmL,3.0mL分别加入到100mL容量瓶中，用水稀释到刻度，进氨基酸分析仪分析，以峰面积和浓度绘制标准曲线如图。,（乳制品中羟脯氨酸）,18,氨基酸自动分析仪法,双语例句,样品的检测与分析分别取市售不同的胶原蛋白粉、明胶、奶粉等样品，按上述样品处理方法进行处理后进样，测定不同样品中17种水解氨基酸和经脯氨酸的含量。若样品中检出有经脯氨酸，则说明有胶原蛋白的存在，可作为乳粉中是否添加动物胶原水解蛋白的依据。该方法样品处理简便易操作，可以对羟脯氨酸直接进行分析，避免了衍生产物的多样性，也不涉及样品中氨基酸衍生不彻底等问题，能快速、准确地判断乳制品中是否添加了动物胶原水解蛋白。,（乳制品中羟脯氨酸）,19,气相色谱法,双语例句,（辨别燕窝的真伪）,1.氨基酸标准溶液的配制2.样品液的制备2.1样品水解：称取约50mg研碎的样品(如为燕窝饮品，则过滤，将固形物供干、研碎后称取)，放于l0ml容量瓶中，加入5一7mL6N盐酸，用高纯氮气排走空气，盖紧塞子，放于145C烘箱中水解4小时，冷却，加氢氧化钠中和，如悬浊，则离心后取5m1澄清液做下一步处理。,反应原理：一定量的气体或液体分析物被注入到柱一端的进样口中。当分析物在载气带动下通过色谱柱时，分析物的分子会受到柱壁或柱中填料的吸附，使通过柱的速度降低。由于每一种类型的分子都有自己的通过速率，分析物中的各种不同组分就会在不同的时间到达柱的末端，从而得到分离。检测器用于检测柱的流出流，从而确定每一个组分到达色谱柱末端的时间以及每一个组分的含量。通过物质流出柱的顺序和它们在柱中的保留时间来表征不同的物质。,20,气相色谱法,双语例句,（辨别燕窝的真伪）,2.2水解液净化：取5m1水解液倒入装有阳离子交换树脂的玻璃柱中，以0.5mL/min的流速过柱，然后用蒸馏水洗柱，直至用硝酸银溶液检不出氯离子为止，再依次用5mL2N氨水溶液和25mL蒸馏水将氨基酸洗脱出来，合并洗脱液，真空蒸发溶液至近干，用少量0.1N盐酸将残液转移到微量反应瓶做下一步处理。2.3氨基酸衍生化：将上述溶液转移于微量反应瓶中，在100砂浴中用氮气吹干，加入。5mL二氯甲烷，再置砂浴，继续吹入氮气，使残存的水分共沸吹出。,吹干后，加入1.5mL3N盐酸一正丁醇溶液，在超声波浴中振荡约2分钟，以加速氨基酸的溶解，盖紧塞子，在110砂浴中酯化5分钟，稍冷，吹入氮气，蒸发正丁醇和盐酸，按前述步骤加入二氯甲烷以除去水分。最后加入0.2m1三氟乙酰酐和0.6m1二氯甲烷，在超声波浴中震荡1一2分钟，盖紧在140砂浴中进行酯化反应20分钟。2.4测定色谱条件OBD-1石英毛细管柱，50mX0.25mm，分流方式进样。,21,高效液相色谱法,双语例句,（测定西洋参中的氨基酸）,操作方法：1.标准溶液的配制2.微波提取和水解：准确称取0.5g西洋参根粉末(过045mm孔径)于微波罐中，并加入20mL含1%苯酚(作为一种抗氧化剂可防止蛋氨酸等氨基酸氧化)的6mo1/LHC1溶