实验十一 Southern杂交分析.pptx

11.植物基因组DNA的Southern杂交,1、植物基因组DNA的提取与纯化2、植物基因组DNA的酶切3、酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southernblotting4、探针序列的获得与标记5、探针与基因组DNA的杂交6、杂交信号的检测,主要步骤,一、Southernblotting（变性DNA转移到膜上）,盐转：20SSC为转移液，转移后DNA不能与尼龙膜共价结合，需要紫外交联。碱转：0.4MNaOH为转移液，转移后的DNA可直接与带正电荷的尼龙膜共价结合。,带正电荷的尼龙膜,分子量大于8kb的DNA分子，从凝胶转移到膜上的效率很低，所以需要把大片段DNA打断成较小的片段，以方便转移。紫外线照射打断大分子量DNA利用脱嘌呤方法打断DNA分子,注：所有操作均需带手套进行！,脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤,脱嘌呤液,中和液,变性液,0.25MHCl,0.5MNaOH1.5MNaCl,0.5MTris-HCl1.5MNaClPH7.5,标准柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）,0.3M柠檬酸三钠3MNaCl,酶切基因组DNA的凝胶电泳,1、配制0.8%或者1.0%的琼脂糖凝胶，注意胶的厚度和胶孔大小是否合适，在能满足需要的情况下，胶浓度越低、胶越薄越好。2、点样，基因组DNA酶切电泳一般用/HindIII作为DNA分子量标记。建议干点，即先加入与凝胶持平的新的电泳缓冲液，使胶孔里没有液体是点样，之后电泳至样品迁移出胶孔后添加电泳缓冲液至高于凝胶液面1-2mm。3、电泳：先用高电压使样品迁移出胶孔，再改用低电压（1-1.5V/cm）低电压过夜，至溴酚蓝到达凝胶下部1.5-2cm时停止电泳。4、凝胶照相，注意紫外照射时间越短越好；然后对凝胶进行修整，切去胶孔和边缘不含DNA的部分，注意保持边缘齐整，在凝胶正面的右上角切掉一小块以示方向，之后用记录凝胶的长和宽；凝胶处理过程中准备一块与凝胶相同大小的尼龙膜和两张滤纸，在尼龙膜的右上角剪掉一小块以示方向，如有需要，用铅笔在右下角写好编号。,琼脂糖凝胶的处理,1、若使用碱转法，可以直接将凝胶中大于8kb的部分置于紫外灯下照射10-15分钟后用于转膜。2、若使用盐转法，则按照脱嘌呤步骤进行凝胶的处理。,盐转法脱嘌呤步骤,1、用0.25M的HCl室温漂洗凝胶至溴酚蓝的蓝色变成黄色（约15min），50rpm；2、用灭菌的双蒸水洗掉凝胶表面的HCL溶液，漂洗5min；3、用变性液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm（使DNA变性），之后用蒸馏水漂洗凝胶；4、用中和液室温漂洗凝胶两次，每次15min，50rpm，之后用蒸馏水漂洗；5、在20SSC中平衡凝胶10min，等待转膜。6、剪好的膜先用灭菌的蒸馏水润湿（膜漂浮在液面上），然后在2SSC中平衡（膜可以没入溶液中）。滤纸用2SSC润湿。,毛细管转移,Southern转膜过程,1、找一块比凝胶大的平台（如大型的制胶板），放入适当的托盘中，加入20SSC转移液。2、平台上铺一层比凝胶稍大的用20SSC浸透的厚滤纸或2-3层普通滤纸，滤纸两头接触到托盘中的20SSC溶液。滤纸和平台之间不能有气泡。3、将凝胶正向放于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。4、用保鲜膜围绕凝胶周边，但不要覆盖凝胶，以此作为屏障，防止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中（液流“短路”现象是导致凝胶中的DNA的转移效率下降的主要原因）。5、切一叠（5-8cm高）与滤纸同等大小的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在上方放一块玻璃板，玻璃板上压重物，使DNA转移持续过夜（可转移5-8小时）。6、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，将湿润的尼龙膜直接进行紫外交联固定DNA到尼龙膜上。对转移后的凝胶，可在紫外透射仪上观察是否还有残留的DNA。,转移方法和膜注意事项：1、凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题，EB也可以加入到样品中。2、所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验。3、根据我们的经验，用20SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。4、碱性转移（如在0.4MNaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker的转移。,DNA的转移和固定,固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：,膜的储存：请根据下表选择膜的储存方法。,二、探针标记和检测,此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原（steroidhapten）去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。,附加仪器与所需试剂,DIG-HighPrimelabeledprobescanbeusedinnorthern,Southern-,anddot-blotanalysis,aswellascolonyandplaquehybridizations.Thiskitoffersrandom-primedlabelingofDNAtemplateswithDIG-11-dUTP,alkali-labile,andchemiluminescentdetectionoftheDIG-labeledhybrids.Thiskitwasassembledwithconvenienceinmind,offeringready-to-useCSPDsuppliedwithadrippingdeviceforeasyapplication,ready-madeblockingsolution,andDIGEasyHybgranules.TheDIG-HighPrimemixtureincludesstabilizedKlenowenzyme,nucleotides,primers,andreactionbuffer,allinoneconvenientreagent.,Application,Sensitivityandspecificity:Standardassayuses1goflinearizedpBR328.Itisusualtoexpect0.8glabeledDNAafter1hoflabeling,and2.3glabeledDNAafter20hreaction.Inadotblothybridization,0.03pgofhomologousDNAisdetectablewithchemiluminescence(probeconcentrationsat20ng/ml).Asinglecopyhumangene(t-PA)isdetectableinaSouthernblot,loading1gofdigestedplacentaDNA.,ProductDescription,DIG-HighPrime,5xconc.,50l（用于探针标记）DIG-labeledControlDNA,20l,(5g/ml)pBR328(linearizedwithBamHI)（用于估测探针产量）DNADilutionBuffer,3x1ml（用于估测探针产量）Anti-digoxigenin-APConjugate,50l（化学发光检测探针-靶序列杂交）CSPD,ready-to-use,50ml（化学发光检测探针-靶序列杂交）BlockingSolution,10 xconc.,4x100ml（化学发光检测探针-靶序列杂交）DIGEasyHybGranules,4x100ml（用于探针与膜的杂交）,KitContents,用20SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。,1、探针标记与标记效率的检测,杂交工作溶液的制备分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后立即在37条件下搅拌5分钟进行溶解。杂交温度适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算Topt.=Tm-（2025）这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt.要比计算出的Tm低20-25。Topt.可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错配要降低1.4），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。,2、预杂交和杂交,杂交液的储存：含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25，可以反复使用几次，在每次使用前需要68新鲜变性10分钟。注意：不可以将杂交液煮沸。,3、洗膜,需要附加的试剂,4、免疫检测,试剂盒工作溶液的制备,免疫检测步骤：完成一张100cm2膜的免疫检测方法,注意：所有的孵育均是在15-25下，