临床生化实验方法的选择和评价.ppt

临床生化实验方法的选择和评价,对于现代化临床化学实验室来说，不但要准确报告实验数据，还要了解实验数据的处理、考核和评价实验方法，正确解释和应用实验数据。,一、实验方法的选择(一)实验方法和标准品的分级,1、方法的分级,1）决定性方法（definitivemethod）准确度最高，系统误差最小，与真值最接近，需要精密仪器，高纯度的试剂用途：用于发展及评价参考方法和一级标准品。缺点：技术要求太高，费用昂贵，设备要求高，测定时间长,）参考方法（referencemethod）：已知其准确度和精主工，干扰因素少，系统误差很小。有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。在条件许可的实验室中经常使用。用途：主要用于鉴定常规方法和试剂盒、鉴定二级标准品，为质控血清定值等缺点：技术性要求高，费用贵，设备要求较高，测定时间较长,3）常规方法（routinemethod）：性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的灵敏度、准确度和特异性，有适当的分析范围，经济适用。这类方法经有关学术组织认可后可称为推荐方法（recommendedmethod）。,ID-MS：同位素稀释-质谱分析法,2、标准品的分级标准品是一种物质，它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，可被用来校正仪器或证实某种实验方法。1）一级标准品：已确定的稳定而均一的物质，可用于校正决定性方法、评价或校正参考方法，为“二级标准品”定值。一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（NBS）发给合格证书，并指明它的性质和有关数据。2）二级标准品：由参考方法定值有关物质的量，主要用于常规方法的标化或为质控物定值。3）控制物：用标准品及参考方法定值。用于质控。,（二）实验方法选择的要求和步骤实验方法选择的要求国际临床化学协会（IFCC）提出：常规方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标。（1）实用性微量快速能便于急诊，适合成套项目分析。费用低廉，包括劳动力与试剂、设备及一般管理费用等。方法简便。应用安全可靠。,（2）可靠性一般具有较高的精密度和准确度，以及较大的检测能力。,2、方法选择的步骤1）广泛查阅资料根据方法选择的要求对已发表的各种方法进行比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据及真实的使用价值。必须仔细分析各种方法的特点，选择适合于本实验室具体条件的方法，并且要判断所选方法能否满足本室工作的需要。,2）选定侯选方法经初步选定的方法称为候选方法。候选方法确定后，应该写出该法的原理与参考文献，所用仪器、试剂的来源、牌号、纯度（或配套试剂盒），标本收集要求，详细的操作步骤，标准曲线和结果计算，文献中列出的性能指标，参考值与参考范围，以及其它应注意的事项与安全防护措施等。,3）进行初步试验为了实用的目的，初试应该包括标准曲线及其重复性；质控血清或新鲜标本的重复试验；分析待测物浓度不同的标本，与公认的参考方法的测定值作对比；要有足够的试验证明仪器与试剂能符合要求。,二、实验方法的评价（一）评价实验与分析误差类型的关系1、方法学评价：通过实验途径测定并评价方法的精确度和准确度，在实验中测定的是不精确度和不准确度，强调的是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。,2、实验误差实验误差：测定值与真值之差1）系统误差（systematicerror，SE）：一系列分析测定的结果对真值或靶值存在有同一倾向的偏差。一般由恒定因素引起，重复测定，重复出现，消除系统误差可提高测定的准确度。分为：恒定误差：由干扰物引起的使测定值与真值存在的误差，与干扰物浓度相关，与被测物浓度无关。比例误差：相对于被测物浓度有相同的百分比误差，误差的绝对值与被测物浓度成正比。,引起原因：方法误差：最严重、最难避免的误差，是方法的分析性能所固有的缺陷所致。可通过方法的选择和评价来减少。仪器和试剂误差：常见仪器波长未校准，量器不准，试剂质量差等。,2）随机误差（randomerror，RE）：是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时引起的误差。误差没有一定的大小和方向。步骤越多，出现的机会越多，不可避免，可减少。主要见于：操作习惯，实验条件改变等。,3、方法学评价指标：1）准确度：测定值与真值之间的符合程度。2）精密度：对同一标本用同一方法在同样条件下多次重复测定，所得各次结果之间的符合程度。3）灵敏度：化学反应中能检出的最小量。4）特异性：分析测定中只对某一成分起反应，其他物质对反应毫无影响或基本无影响。5）线性范围：实验方法所能检测标本中某物质的浓度范围。,（二）方法评价实验1、重复性实验：实验的目的是检测候选方法的随机误差。方法是对同一材料(标准液、质控液、标本等)分成数份试验标本进行多次分析测定试验形式与方法(1)批内重复性试验：用同一份标本在短时间内用候选方法作多次(一般20次)重复测定。(2)日内重复性试验：在一天内对一个或数个标本作数批重复测定。(3)日间重复性试验：将同一标本分成数份，按方法每天测一次，连续测定20天观察结果变异。,2、回收试验回收是指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析物的能力，用回收率表示。本试验的目的是检测候选方法的比例系统误差。,1）方法将被测物标准液加入病人标本中，成为分析标本；原病人标本中加入等量的无被测物的溶剂作基础标本；然后用候选方法测定并得到各自浓度。2）计算回收浓度分析标本测得浓度一基础标本测得浓度。加入浓度回收率（%）=,标准液量（ml）,病人样品量（ml）+标准液量（ml）,X标准液浓度,回收浓度,加入浓度,X100%,注意事项：吸量准确；加入标准液后，其实验样品的被子测浓度最好达到医学决定水平；总浓度必须在方法分析范围内；需加入高中低不同浓度回收试验，计算平均回收率；加入标准液的体积一般在10%内；重复2-3次。,3、干扰试验干扰试验是用来检测候选方法的恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同。,方法基本与回收试验一样，但在病人标本中加入的是疑有干扰或非特异性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本，原病人标本加入相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本，然后用候选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质产生的干扰所引起的误差，即干扰值。干扰值=分析标本测得值-基础标本测得值,注意事项被试验的物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、药物等可疑干扰物的浓度：干扰物浓度有可能达到病理标本最高浓度值。本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物作用引起的误差。消除干扰常用方法空白对照：试剂空白：常见标本空白：物理、化学方法分离干扰物双波长或多波长法检测排除干扰误差较大又无法消除，则改进或更换方法。,(四)方法比较试验（对比试验）,用于检测候选方法的系统分析误差。对所得数据进行分析，可提供系统误差的性质（恒定或和比例误差）对一组病人的标本用候选方法和比较方法同时进行分析测定，观察二者之间的差异。这是考验候选方法是否可采用的重要措施。,在进行临床化学常规方法的评价时，最好选择参考方法作为比较方法若采用已知偏差法，则有部分误差来自比较方法（与已知偏差一致的那部分误差），剩余的则属于侯选方法。若采用未知偏差法，分析误差可能来源于二者之一或两者都有，难以分析。,三、临床生化实验诊断试验的性能评价（一）诊断试验的选择原则1、临床灵敏度：诊断试验检出阳性病人的百分率。临床灵敏度=,实际检出阳性数,理论阳性数,X100%,理想试验的诊断灵敏度为100%。,2、诊断特异度用诊断试验检出的阴性结果的百分率，表示非患病者中诊断试验正确确定非患病者的能力，又称为真阴性率。诊断特异度=理想试验的诊断特异性为100%。,实际检查结果为阴性数,全部受检的未患病者总数,X100%,（二）参考值与医学决定水平的确定1参考值1）概念是指从某一参考个体或参考人群中获得的测定数值。参考范围：以95%的可信性为界，以X2S表示在临床检验中，将获得的观察值即某项检验结果与某个标准的数据进行比较，借以对资料作出合理解释。标本来源：个体基础参考值群体基础参考值,2）制订（）参考个体的选择（）测定方法的选择与标准化（）参考值及其范围的确定单值估计：过高为异常，以单值上限为参考值界限区间估计：过高和过低均为异常，制定参考值上、下限,注意事项：正确选择受检对象，以受检对象的确对所反映的总体具有代表性和不存在对指标具有影响的因素为原则；合理规定参考人群的条件，如年龄、性别、民族、职业、女性的月经期、妊娠和哺乳，以及标本采集的时间和地区因素等；保证一定数量的受检人数，一般应有100例以上，若指标分布呈偏态时应在120例以上，特殊情况至少也应30例以上；测定方法应标准化，保证测定结果的可靠性和可比性。根据专业知识确定单、双侧位界，严格按照统计要求进行测定结果的处理。,参考值在临床应用中应注意的问题参考值的使用有一定的范围，仅适合于符合参考个体要求的参考人群。参考值范围通常定为2S，有时称为95%可信区间，即此范围仅覆盖研究人群的95%，因此，参考值范围不能盲目地作为正常与疾病的分界点。综合评价，参考值在作为诊断和监测目的使用时，应注意年龄、性别、饮食、药物、个人习惯和体力锻炼等因素的影响。,2、医学决定水平是一限值，可用来排除或确定某一临床情况或预后将