第八章蛋白质的测定PPT演示课件

第八章蛋白质的测定,1,一、测定食品中蛋白质含量的意义二、常量凯氏定氮法三、微量凯氏定氮法四、自动凯氏定氮仪五、氨基酸的分析,2,一、概述,（一）测定意义1、蛋白质作为三大供能物质，是食品的重要营养指标。2、人体组织的构成成分。3、构成体内各种重要物质4、蛋白质不是越多越好（增加肾负担，骨质疏松）5、不同食品中蛋白质的含量不同，可作为质量检验的一种重要手段。,3,（二）各种食物中蛋白质的含量,在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。,4,新型蛋白质类食品,单细胞蛋白：螺旋藻螺旋藻植物蛋白质含量最高达70%，相当于牛肉的3倍，包含全部八种人体所需又无法自身合成的氨基酸，是人类最为最理想的蛋白质天然宝库。,5,（三）测定原理,凯氏定氮法通过测定食品中N的含量，再乘以蛋白质系数，就可以得到蛋白质的含量=N6.25=蛋白质含量而一般来说，食品中蛋白质的含氮量为16，所以，测得的含氮量再乘以6.25，就能得到蛋白质的含量。,6,二、凯氏定氮法（国标法）,1、原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,7,化学反应方程式,2NaOH(NH4)2SO42NH3Na2SO42H2O,2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3,2NH2(CH)2COOH13H2SO4(NH4)2SO46CO212SO216H2O,8,2、仪器,500ml凯氏烧瓶定氮蒸馏装置,9,3、试剂,硫酸(密度为1.8419g/L)；硫酸铜(CuSO4.5H2O)；硫酸钾；K2SO440%氢氧化钠；混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%甲基蓝乙醇溶液，临用时按2:1的比例混合。或者0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1:5的比例混合；2%硼酸溶液：0.1molL盐酸标准溶液,10,浓H2SO4,在消化阶段起决定性作用具有脱水性：使有机物脱水后被炭化为C、H、N具有氧化性：将有机物彻底氧化C+2H2SO4CO2+2H2O+2SO23SO2+2N+3H2O2NH3+3SO32NH3+H2SO4（NH3）2SO4,11,(CuSO4.5H2O),在消化阶段作催化剂，在蒸馏反应时作指示剂。C+2CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+H2SO42CuSO4+2H2O+SO2有机物被全部消化后，溶液呈清澈的蓝绿色。,12,K2SO4,在消化时提高溶液的沸点K2SO4+H2SO42KHSO43304002KHSO4K2SO4+SO2+H2O在消化过程中，随着H2SO4的不断分解，水分不断蒸发，K2SO4的浓度逐渐增大，加速了对有机物的分解作用。K2SO4与H2SO4的用量比不宜过大，否则会损失氨。,13,4、操作步骤,样品消化蒸馏、吸收滴定,14,（1）消化,准确称取固体样品0.22.0g，液体1020ml，置于500ml凯氏烧瓶中。加入硫酸铜0.2g，硫酸钾6g，浓硫酸20ml，摇匀。置于电炉上，成45度角，小火加热。待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液体变蓝绿色透明，再继续加热0.51h，取下冷却后，小心加入20ml水，转移至1000ml容量瓶，定容。,15,（2）蒸馏、吸收,按左图连接好装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶下（瓶中有50ml4硼酸和混合指示剂）。放松夹子，加入7080ml氢氧化钠溶液，至瓶中溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再加入100ml蒸馏水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（250ml）。,16,（3）滴定,将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸用量。计算公式,W蛋白质的质量分数，%；c盐酸标准液的浓度，mol/L；V试剂滴定消耗标准液量，mL；m样品质量，g；0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol；F蛋白质系数，6.25。,17,（4）注意事项,消化时间一般约4小时，过长会引起氨的损失。但若赖氨酸或组氨酸含量较多时需要延长时间。样品中脂肪或糖较多时消化时间要长些，还应注意发生的大量泡沫，为防止其溢出瓶外，在开始消化时要小火加热，并不时摇动，必要时甚至可以停止加热半小时。蒸馏装置不能漏气，在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象，蒸馏完毕后先将吸收瓶脱离冷凝管，继续蒸馏1分钟，将附着在尖端的标准酸液完全洗入吸收瓶，再取下来，最后灭火。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。,18,三、微量凯氏定氮法,原理与常量凯氏定氮法相同试剂除0.01molL盐酸标准溶液外其余也同常量凯氏定氮法，只是加试剂量减少了。设备区别也不大操作同常量凯氏定氮法,19,20,设备安装,21,步骤,采样（固体采样、液体采样）样品预处理样品分析样品数据处理撰写分析报告,22,23,四、自动凯氏定氮仪,称取样品（通常为一克）加入试剂，消解催化剂；在预定温度下将样品（6-40个随消化炉的不同而不同）同时消化（一般条件为420度，30-45分钟）；经冷却和稀释，一支消化管和接受瓶放置到仪器上。按下start键，起动碱泵加碱，蒸汽泵加蒸汽，硼酸泵向接受瓶中加硼酸。选择蒸馏时间四五分钟，自动完成蒸馏；滴定，计算氮及蛋白含量。,24,五、氨基酸的分析,甲醛滴定法发酵工业中用得较多，用于测定发酵过程中氨基酸的含量变化。,25,1、甲醛滴定法的原理,氨基酸分子中含有碱性氨基和酸性羧基，在水溶液中以双性离子（内盐）存在，因此不能直接用酸滴定氨基，也不能用碱滴定羧基。将氨基酸（水溶液）用中性甲醛水溶液处理，常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，促使一NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，碱性消失，溶液显示出羧基的酸性，可以用酚酞作指示剂，直接用标准碱液滴定，以间接方法求出样液中氨基酸的含量，终点pH为8.5-9.5。,26,2、试剂和器材,（1）01molL标准氢氧化钠溶液（2）酚酞指示剂0.1酚酞的50乙醇溶液（3）中性甲醛溶液在50mL3637分析纯甲醛溶液中加入1mL01酚酞乙醇水溶液，用01molL的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。（4）锥形瓶微量滴定管吸管磁力搅拌器pHS-3型数字显示酸度计,27,3、操作过程,准确吸取样液5.0ml于100ml容量瓶中，加水至刻度。摇匀后准确移取20.0ml于250ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用标准NaOH滴定至pH为8.2，记录消耗的NaOH毫升数，可计算总酸度。加10.0ml甲醛于烧杯中，混匀，再用标准NaOH滴定至pH为9.2，记录消耗的NaOH毫升数。同时取80ml蒸馏水先用标准N