DNA残留检测方法

DNA残留残留检测检测方法比方法比较较及及Threshold特点和特点和优势优势 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 主要内容主要内容 DNA残留检测应用领域及其重要意义残留检测应用领域及其重要意义 常用几种检测方法及其各自优缺点常用几种检测方法及其各自优缺点 （ 光吸收、荧光法、杂交法、荧光定量光吸收、荧光法、杂交法、荧光定量PCR法）法） Threshold方法的原理和特点方法的原理和特点 竞争竞争分析分析 总结总结 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. DNADNA残留检测主要应用领域及其趋势残留检测主要应用领域及其趋势 1： 随着生物医药技术发展，越来越多哺乳动物细胞生产治疗性疫随着生物医药技术发展，越来越多哺乳动物细胞生产治疗性疫 苗和治疗性生物制品；苗和治疗性生物制品； 2： 中国市场目前现状中国市场目前现状 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 常见生物制品和对其外源常见生物制品和对其外源DNADNA含量要求含量要求 1： 单克隆抗体（单克隆抗体（注射用抗人注射用抗人T细胞细胞CD3鼠单抗鼠单抗）、重组蛋白质制品）、重组蛋白质制品 、疫苗（药典收录需要检测残留、疫苗（药典收录需要检测残留DNA的疫苗包括乙脑、狂犬、出血的疫苗包括乙脑、狂犬、出血 热、脊髓灰质炎、甲肝疫苗等）热、脊髓灰质炎、甲肝疫苗等） 2： WHO、EU、FDA及及SFDA等对外源等对外源DNA残留限量限定不同残留限量限定不同 狂犬疫苗为例：如中国药典对残留限定在狂犬疫苗为例：如中国药典对残留限定在100pg/每人份每人份 剂量、脊髓灰质炎剂量、脊髓灰质炎10pg/每人份剂量每人份剂量 WHO最新认定不高于最新认定不高于10ng均为安全均为安全 FDA限定为限定为100pg/每人份剂量每人份剂量 目前需要：稳定且灵敏度高的检测方法目前需要：稳定且灵敏度高的检测方法 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. DNADNA残留检测重要性残留检测重要性 为什么要检测？为什么要检测？ 细胞（细胞（Vero、CHO）培养产生的）培养产生的 生物制品含有特定的杂质，生物制品含有特定的杂质， 会包括宿主细胞会包括宿主细胞蛋白和蛋白和DNA 对人可能产生危害：对人可能产生危害： 残留外源残留外源DNA可能造成插入突变可能造成插入突变 导致抑癌基因失活导致抑癌基因失活癌基因被激活等，癌基因被激活等， 最终造成疫苗使用者致癌；最终造成疫苗使用者致癌； 证实原代细胞为安全的证实原代细胞为安全的 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 光吸收法检测光吸收法检测DNADNA 原理：原理：DNA或者或者RNA链链上碱上碱基的基的苯环结构在紫光区具有较强吸苯环结构在紫光区具有较强吸 收，其吸收峰在收，其吸收峰在260nm处处 DNA或或RNA的的浓浓度度 OD260=1.0相当于相当于 50 g/ml双双链链DNA(dsDNA) 40 g/ml单链单链DNA/RNA 20 g/ml寡核苷酸寡核苷酸(Oligos) 优点：快速简便优点：快速简便 缺点：不能区缺点：不能区DNA还是还是RNA、检测灵敏度不高、易受到杂质干检测灵敏度不高、易受到杂质干 扰（蛋白质或者盐类）扰（蛋白质或者盐类） 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 荧光法检测荧光法检测DNADNA（20102010版药典收录版药典收录PicogreenPicogreen） 原理：荧光染料分子直接与双链原理：荧光染料分子直接与双链DNADNA结合后，经带有荧光功能的结合后，经带有荧光功能的 酶标仪激发后产生荧光信号酶标仪激发后产生荧光信号 双双链链DNA (dsDNA) PicoGreen (Molecular Probes) 优点（与吸收光比）：特异性较好、具有一定程度耐盐，乙醇优点（与吸收光比）：特异性较好、具有一定程度耐盐，乙醇 和蛋白干扰、检测灵敏度高（和蛋白干扰、检测灵敏度高（20102010版中国药典给出数据：可达版中国药典给出数据：可达 300pg300pg左右，线性左右，线性1.251.25- -80ng/ml R0.9980ng/ml R0.99，线性范围较好），线性范围较好） 缺点：要做标曲、荧光信号易受干扰、有些生物制品对缺点：要做标曲、荧光信号易受干扰、有些生物制品对DNADNA检测检测 灵敏度达灵敏度达100pg100pg以下，以下，PicogreenPicogreen不能达到不能达到 dsDNA picogreen Ex Em 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 荧光法检测荧光法检测DNADNA（20102010版药典收录版药典收录PicoGreenPicoGreen） 重组制品外源残留检测要求（中国药典）重组制品外源残留检测要求（中国药典） 中中检所应用检所应用PicoGreenPicoGreen所检测生物制品种类所检测生物制品种类 注射注射用重组人干扰素用重组人干扰素 （E.coliE.coli） 注射用重组人干扰素注射用重组人干扰素 1 1b b （E.coliE.coli） 注射注射用重组人用重组人干扰素干扰素 2b (2b (酵母酵母) ) 注射注射用重组人干扰素用重组人干扰素 2b 2b （假单胞菌假单胞菌） 注射用重组人干扰素注射用重组人干扰素 2b 2b （ E.coli E.coli ） 注射注射用重组人干扰素用重组人干扰素 2a2a（酵母酵母） (E.coli)(E.coli) 注射注射用重组链激酶用重组链激酶 注射注射用重组人白介素用重组人白介素- -2 2（I I）（）（ E.coli E.coli ） 重组重组人干扰素人干扰素 2a2a栓栓 重组人干扰素重组人干扰素2b2b凝胶凝胶 重组人干扰素重组人干扰素2b2b喷雾剂喷雾剂( (假单胞菌假单胞菌) ) 等等等等 要求要求不高于不高于10ng10ng 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 荧光法检测荧光法检测DNADNA（20102010版药典收录版药典收录PicoGreenPicoGreen） 注射用重组人促红素（注射用重组人促红素（CHOCHO细胞）细胞） 重组乙型肝炎疫苗重组乙型肝炎疫苗(CHO(CHO细胞细胞) ) 要求不高于要求不高于100pg100pg和和10pg10pg（PicoGreenPicoGreen不适用）不适用） 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 杂交法检测杂交法检测DNADNA 原理：基于原理：基于SouthernSouthern原理，样品中外源性原理，样品中外源性DNADNA经变性为单链后吸经变性为单链后吸 附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的特异性单链附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的特异性单链DNADNA复性复性 而重新结合成为双链，称之为杂交；而重新结合成为双链，称之为杂交； 特异性单链特异性单链DNADNA（探针）：标记上酶、放射性同位素、地高辛、（探针）：标记上酶、放射性同位素、地高辛、 生物素等生物素等 地高辛探针优势：操作方便、灵敏度高，稳定性好、无内源性地高辛探针优势：操作方便、灵敏度高，稳定性好、无内源性 背景等；背景等； 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 地高辛杂交法检测地高辛杂交法检测DNADNA（药典收录）（药典收录） 简介简介: :植物中提取植物中提取- -异羟基洋地黄毒苷异羟基洋地黄毒苷( (D Digoxin )igoxin )类固醇半抗原类固醇半抗原 分子分子 原理（原理（VeroVero细胞表达的狂犬病疫苗）：标记特异性单链细胞表达的狂犬病疫苗）：标记特异性单链DNADNA后，后， 与吸附在固相膜（尼龙膜）样品单链与吸附在固相膜（尼龙膜）样品单链DNADNA杂交，显色并与已知含杂交，显色并与已知含 量阳性量阳性DNADNA对照比对后，得到外源样品中含量，理论灵敏对照比对后，得到外源样品中含量，理论灵敏 度达到度达到10pg10pg左右；左右； 不足：需要厂家提供细胞或工程菌、检测样品需要量大、比色不足：需要厂家提供细胞或工程菌、检测样品需要量大、比色 法（不能定量）、实验周期长且操作繁琐、干扰因素多、对法（不能定量）、实验周期长且操作繁琐、干扰因素多、对PHPH 值要求严格等值要求严格等 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. qPCRqPCR法检测法检测DNADNA 原理：实时荧光定量核酸扩增检测系统（原理：实时荧光定量核酸扩增检测系统（RealReal- -time time Quantitative PCR Detecting SystemQuantitative PCR Detecting System） SYBR Green ISYBR Green I荧光染料与荧光染料与 DNADNA双链具有高亲和力，结合后荧光强度可增双链具有高亲和力，结合后荧光强度可增 加加800800- -10001000倍；在溶液中倍；在溶液中SYBR Green ISYBR Green I过量时，荧光强度与双链过量时，荧光强度与双链DNADNA浓度成正浓度成正 比。因此可用于溶液中比。因此可用于溶液中 dsDNA dsDNA 的定量的定量 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 磁珠法抽提磁珠法抽提 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 优点：时间短、可定优点：时间短、可定 量、特异性强、灵敏量、特异性强、灵敏 度最高、动态学范围度最高、动态学范围 宽（宽（ 3ng3ng- -30fg30fg）、减）、减 少样品的使用量等少样品的使用量等 不足：只能针对特定不足：只能针对特定 宿主细胞宿主细胞DNADNA检测（检测（ CHOCHO、EcoliEcoli、VeroVero） 不能检测总不能检测总DNA DNA 、需、需 设计引物设计引物 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 认识认识Threshold系系统统(阈值阈值法法) ThresholdThreshold能够分析的大量生物分子能够分析的大量生物分子 蛋白蛋白、宿主细胞蛋白、多肽、宿主细胞蛋白、多肽、抗体、抗体、胰岛素、病毒、胰岛素、病毒、 BSABSA、总总DNADNA、特异序列、特异序列DNA DNA 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Molecular Devices ThresholdMolecular Devices Threshold 仪器结构和关键部分仪器结构和关键部分 多功能过滤装置多功能过滤装置 过滤口过滤口 检测器检测器 硝酸纤维素膜棒硝酸纤维素膜棒 过滤块过滤块 过滤装置底座过滤装置底座 如果仪器加配两个过滤部 件可同时过滤96个样 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 应应用用领领域域 ThresholdThreshold应用（三应用（三大块）大块） 基础研究：监测基因基础研究：监测基因 (DNA(DNA、mRNAmRNA、蛋白、蛋白) )表达水平，表达水平， 能能 准确对准确对PCRPCR后的后的DNADNA定量分析；定量分析； 临床试验：临床试验： 药药代代动力学实验中可以动力学实验中可以检测病人血液中药物检测病人血液中药物 浓度浓度水平，评价药物免疫原性研究水平，评价药物免疫原性研究 生物制药生物制药 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold系系统统在生物制在生物制药领药领域域 可以广泛应用于生物制药领域的各个环节，具有很高灵敏可以广泛应用于生物制药领域的各个环节，具有很高灵敏 度（皮克级）和可靠性（度（皮克级）和可靠性（FDAFDA、EMEAEMEA），能够快速和准确），能够快速和准确 把握产品在各个环节中可能出现的问题，是理想的质控工把握产品在各个环节中可能出现的问题，是理想的质控工 具；具； 发酵环节发酵环节 工艺开发工艺开发 产品检测产品检测 培养基污染分析 产品纯度分析 直接或者竞争法 优化收获时间提高产量 去除污染物 灵敏且快速检测产品污染情 质粒拷贝数分析 纯化步奏优化 快速检定产品质量 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold与与传统检测传统检测方法比方法比较优势较优势（特点）（特点） 可以检测可以检测DNADNA、mRNAmRNA、蛋白、多肽、蛋白、多肽 高灵敏度（总高灵敏度（总DNADNA含量低于含量低于10pg10pg、ILAILA比比ELISAELISA灵敏灵敏1010倍）倍） 精确性和可重复性高（精确性和可重复性高（DNA 5 DNA 5 15 % CV15 % CV，蛋白，蛋白5 5 10 % 10 % ） 速度快（速度快（6 6- -8 8小时）小时） 无放射性污染无放射性污染 具有广泛用途的检测技术具有广泛用途的检测技术 MDMD提供全套应用解决方案，包括仪器、试剂、分析软件、技术提供全套应用解决方案，包括仪器、试剂、分析软件、技术 支持支持 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 保保证证其高灵敏度因素其高灵敏度因素 在均匀液相反应环境在均匀液相反应环境 特异性捕获反应复合物，并浓缩与固相载体上特异性捕获反应复合物，并浓缩与固相载体上 利用很小体积反应体系就可以检测酶活性的变化利用很小体积反应体系就可以检测酶活性的变化(7PI 7时时 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold 检测总检测总DNA 检测检测DNADNA污染重组污染重组蛋白蛋白 抗炎蛋白、心房肽、抗炎蛋白、心房肽、CD4CD4、集落刺激因子、促红细胞生、集落刺激因子、促红细胞生 成素、促卵泡激素、成素、促卵泡激素、GP120GP120、血红蛋白、水蛭素、人类、血红蛋白、水蛭素、人类 生长激素、人血清白蛋白、免疫毒素、胰岛素、胰岛生长激素、人血清白蛋白、免疫毒素、胰岛素、胰岛 素生长因子、促胰岛素、干扰素、白细胞介素、单克素生长因子、促胰岛素、干扰素、白细胞介素、单克 隆抗体、神经肽、垂体生长激素、超氧化物歧化酶、隆抗体、神经肽、垂体生长激素、超氧化物歧化酶、 组织型纤溶酶原激活物、尿激酶、疫苗、病毒抗原组织型纤溶酶原激活物、尿激酶、疫苗、病毒抗原 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold（ （ Immuno-Ligand Assay） ） ILAILA检测分析种类检测分析种类 宿主细胞蛋白（宿主细胞蛋白（E.coliE.coli、 哺乳动物、酵母）、多肽哺乳动物、酵母）、多肽 、蛋白、蛋白、蛋白、蛋白A A、蛋白、蛋白G G、 抗体、抗体、BSABSA、转铁蛋白、白、转铁蛋白、白 细胞介素、细胞介素、 临床领域：甲型肝炎包膜临床领域：甲型肝炎包膜 蛋白检测、治疗性人源化蛋白检测、治疗性人源化 单抗单抗 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold(ILA 抗体抗体标记标记) 抗体来源（自己纯化、商品抗体来源（自己纯化、商品 化）化） 抗体抗体标记（生物素和荧光素标记（生物素和荧光素 ） MD Kit R9002MD Kit R9002（两瓶（两瓶5mg/5mg/瓶瓶生生 物素和两瓶物素和两瓶5mg/5mg/瓶瓶荧光素荧光素） 确定蛋白用量确定蛋白用量 确定标曲范围、优化孵育时确定标曲范围、优化孵育时 间和温度间和温度 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold（ （ Sandwich Assay） ） 检测检测原理原理 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold（ （ Competitive Assay） ） 检测检测原理原理 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. Threshold 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 仪仪器器检测结检测结果果(空白空白对对照照组组) 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 仪仪器器检测结检测结果（果（标标准品准品组组） ） 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 曲曲线拟线拟合方式合方式 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise indicated are the property of Molecular Devices, Inc. 质质控（可靠性和重控（可靠性和重复复性）性） 重组蛋白制品中总重组蛋白制品中总DNADNA含量的检测含量的检测 2011 Molecular Devices, Inc. Devices products are for Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Molecular Devices, the Molecular Devices logo, and all other trademarks unless otherwise ind