ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）1。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析2。 DTNB TNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-14.25*103M-cm-之间3,4。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=bc，其中A为吸光度，是摩尔吸收光系数或消光系数，单位为升/（摩尔厘米）L/(molcm）。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1. EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系5。2. 在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不同，要根据选择的缓冲液来确定5。另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感6。3. DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解7,8。4. 摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降4. 试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/mlG-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml10k超滤膜 PALL2.试剂Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20 ug/小瓶。加入20 ul 50mM NH4HCO3，pH7.8溶解，配成1 ug/ ul的酶液。1M DTT 刘春凤提供TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO 2007-208241-001(including -Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard I,protein calibration standard )PEG肽段反相分离流动相 A液：0.1%TFA/H2O B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O3.仪器质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflex(厂内编号KC2007-011)Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）反相柱：Symmetry C18 5um 300 4.6*150mm， Lot NO 0206360111，内部编号1655高压液相仪器：， （UV/Visible Detector）试验过程： 一、缓冲液替换PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，pH 7.8。使用50mM NH4HCO3作为空白对照，样品用50mM NH4HCO3稀释一倍后在DU-800 紫外分光光度计上测浓度。PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。二、酶切处理 1）取37ul G-CSF,共400ug，加入125.5ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 取63.ul PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin 10ul，往G-CSF中加入Trypsin 10ul，同时各加入1ul 1M DTT使终浓度为5mM。另做一空白对照，往300ul 50mM NH4HCO3中加入Trypsin 15ul。 37反应，开始时间为。三、肽段反相分离TimeFlow%A%B0110001110001516832451653550154467014951801208085110009511000G-CSF Trypsin+DTT 反相分离收样：TimeFlow%A%B0110001110001516832451653550154467014951801208085110009511000PEG-G-CSF Trypsin+DTT 反相分离收集到 之间的信号峰，交由崔文喜冻干 四、ELLMAN试剂测定自由巯基 由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。 根据我们所查找到得文献，采用的参数如下： 反应缓冲液：0.10M 磷酸钠+0.001M EDTA ，pH 7.27 温度：25 在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.150.09*103LM-cm-9.1) 标准曲线用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，160 umDTT，320 umDTT。用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。准备两个比色皿。加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，35min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。A412nm=Afinal-（3.1/3.2）(ADTNB-Abuffer),制作标准曲线。2）样品巯基测定加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，35min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。A412nm=Afinal-（3.1/3.2）(ADTNB-Abuffer)，根据标准曲线测定巯基。参考文献：1)THEODOREW.T et al.Sensitive Quantitative Analysis of Disulfide Bonds in Polypeptides and Proteins. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 18 1- I88 ( 1984).2) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).3) Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys., 74, 443. (1958).4) Peter Eyer,et al. Molar absorption coe?cients for the reduced Ellman reagent: reassessment. Analytical Biochemistry 312 (2003) 2242275) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).6)Sigma 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 产品说明书。7) Riddles, P.W. et al., Anal. Biochem., 94, 75 (1979)8) Danehy, J.P, Elia, V.J. a